İki fotonlu floresan mikroskobun teknik özellikleri ve kullanım becerileri
İki fotonlu floresan mikroskopi, lazer taramalı konfokal mikroskopi ile iki fotonlu eksitasyon teknolojisini birleştiren yeni bir teknolojidir.
İki fotonlu uyarımın temel ilkesi şudur: yüksek foton yoğunluğu durumunda, flüoresan moleküller aynı anda iki uzun dalga boylu fotonu soğurabilir ve kısa bir sözde uyarılmış durum ömrü süresinden sonra daha kısa dalga boylu bir foton yayabilir. . ; Etki, bir flüoresan molekülü uyarmak için uzun dalga boyunun yarısı kadar dalga boyuna sahip bir foton kullanmakla aynıdır. İki fotonlu uyarım, yüksek bir foton yoğunluğu gerektirir. Hücrelere zarar vermemek için iki fotonlu mikroskopi, yüksek enerjili mod kilitli darbeli lazerler kullanır. Bu lazer tarafından yayılan lazer yüksek tepe enerjisine ve düşük ortalama enerjiye sahiptir, darbe genişliği sadece 100 femtosaniyedir ve periyodu 80 ila 100 megahertz'e ulaşabilir. Darbeli lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal açıklıklı bir objektif lens kullanırken, objektif merceğin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki fotonlu uyarım yalnızca objektif merceğin odak noktasında meydana gelir, yani iki foton mikroskobu, Floresan algılama verimliliğini artıran konfokal bir iğne deliğine ihtiyaç duymaz. Morfoloji, moleküler hücre biyolojisi, nörobilim ve farmakoloji alanlarında önemli bir araştırma yöntemidir.
1. İki fotonlu mikroskopinin ortaya çıkışının arka planı - geleneksel lazer konfokal mikroskopinin iki sınırlaması:
1) Biri fototoksisite fenomenidir: çünkü konfokal iğne deliği, yüksek çözünürlüklü bir görüntü elde etmek için yeterince küçük olmalıdır ve küçük açıklık, odak düzleminden yayılan floresan da dahil olmak üzere numuneden yayılan floresansın büyük bir bölümünü bloke edecektir. karşılık gelen Evet, uyarma ışığı, yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde edecek kadar güçlü olmalıdır; ve yüksek yoğunluklu lazer, sürekli tarama sırasında flüoresan boyanın hızla solmasına neden olur ve tarama ilerledikçe flüoresan sinyali giderek zayıflar.
2) Fototoksisite başka bir sorundur. Lazer ışıması altında, birçok flüoresan boya molekülü singlet oksijen veya serbest radikaller gibi sitotoksinler üretecektir, bu nedenle numune yoğunluğunu korumak için deneyde uyarma ışığının tarama süresi ve optik güç yoğunluğu sınırlandırılmalıdır. aktif. Aktif numuneler üzerinde yapılan araştırmalarda, özellikle aktif numunelerin büyüme ve gelişmesinin çeşitli evreleri, fotoağartma ve fototoksisite bu çalışmaları çok sınırlı kılmaktadır.
2. İki fotonlu mikroskopların genellikle ultraviyole uyarma lazerleriyle donatılmasına gerek olmadığını neden söylüyorsunuz?
İki fotonlu mikroskopi, iki fotonlu uyarma etkisine dayanan bir floresan uyarma teknolojisidir: floresan boya molekülleri, aynı anda iki düşük enerjili fotonu emerek uyarılabilir (iki fotonun floresan moleküllerine ulaşması arasındaki zaman aralığı 1 femtosaniyeden azdır) ), uyarma etkisi, 1/2 dalga boyunda yüksek enerjili bir fotonun soğurulmasına eşdeğer olabilir. Örneğin, kırmızı dalga boylarında iki fotonun soğurulması, ultraviyole soğuran bir moleküle eşdeğerdir. Uzun dalga boylu fotonlar hücreler tarafından kolayca emilmez, bu nedenle canlı hücrelere karşı fototoksisite azalır ve ayrıca ışıkla ağartma da azalır. Bu şekilde, sadece ultraviyole uyarma işlevini yerine getirmekle kalmaz, aynı zamanda ultraviyole ışığın numuneye zarar vermesini de önler.
3. İki fotonlu mikroskobun lazerini özel kılan nedir?
İki foton absorpsiyonunun olasılığı, gelen iki fotonun uzay ve zamanda ne kadar yakın çakıştığına bağlıdır (iki foton 10-18 saniye içinde varmalıdır). İki foton absorpsiyon kesiti küçüktür ve yalnızca büyük bir foton akısına sahip bölgelerdeki floroforlar uyarılır. Bu nedenle, kullanılan lazerlerin çoğu, pikosaniye veya femtosaniye tarama hızlarına ulaşabilen ve çok yüksek tepe gücüne ve düşük ortalama güce sahip titanyum safir lazerlerdir, böylece ışıkla ağartma ve fototoksisite azaltılabilir veya ortadan kaldırılabilir. En önemli şey, iki fotonun aynı anda uyarılmasını sağlayabilen, küçük bir aralıkta çok yüksek bir foton yoğunluğu sağlamaktır.
4. İki fotonlu uyarımın avantajları nelerdir?
1) Boyanın seçiciliğini artırın: konfokal sistem lazerinin uyarım ışık aralığı (Ar, Ar/Kr, HeNe) 488nm - 647nm'dir. Bu, UV uyarımlı floresan boyalarla, örneğin DAPI , Hoescht ile deney yapmak anlamına gelir. İki fotonun uyarma dalga boyu, tek fotonun iki katıdır, bu nedenle ultraviyole ile uyarılan boyalar, yakın kızılötesi ışıkla uyarılabilir.
2) Işıkla ağartmayı azaltın: Işıkla ağartmadaki azalma nedeniyle, floresan rezonans enerji transferi (FRET) için CFP/YFP kullanan deneylerin başarı oranı artar.
3) Özel bir objektif lens gerekmez: Donanım açısından, yakın kızılötesi ışığın dalga boyuna sahip UV ile uyarılan boyaların uyarılması, özel UV optik bileşenleri gerektirmez.
4) Sinyal-gürültü oranını iyileştirin: uyarım ışık dalga boyu ve yayılan ışık dalga boyu, sinyal-gürültü oranını iyileştiren büyük bir farka sahiptir.
5) Odak noktasına lokalize ağartma: Floresans uyarımı yalnızca objektifin odak noktasında meydana geldiğinden, konfokal iğne deliğine gerek yoktur. Bu, ışık algılamayı iyileştirir ve ışıkla ağartma yalnızca odak noktasında gerçekleşir.
6) Numunelere nüfuz etmesi daha kolay: Kızılötesi dalga boyu ışığı hücreler tarafından kolayca dağılmaz ve daha derin numunelere nüfuz edebilir.
5. Lazer taramalı konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu mikroskopinin yaptığı en büyük gelişme nedir?
1) Azaltılmış ışıkla ağartma.
2) Azaltılmış fototoksisite.
3) Dağılması kolay değildir ve beyin dilimleri gibi kalın örneklere nüfuz etmek daha kolaydır.
