Polarize Mikroskopta Polarizörleri Kalibre Etmeye Yönelik Standart Prosedür
Floresan mikroskobu, sıradan ışık kaynaklarının aydınlatması altında numuneleri gözlemlememesi açısından sıradan optik mikroskoptan farklıdır. Bunun yerine, mikroskop altında numunenin içindeki floresan maddeleri uyarmak için belirli bir dalga boyunda ışık (genellikle ultraviyole ışık, mavi mor ışık) kullanır ve bunların floresans yaymasına neden olur. Bu nedenle, floresans mikroskobunda ışık kaynağının rolü doğrudan aydınlatma değil, numune içindeki floresan maddeleri uyaracak bir enerji kaynağı olmaktır. Numuneleri gözlemleyebilmemizin nedeni, ışık kaynağının aydınlanmasından değil, numune içindeki floresan maddelerin uyarılmış ışık enerjisini emdikten sonra sergilediği floresans olgusundan kaynaklanmaktadır. Bundan, floresans mikroskobunun özelliğinin esas olarak ışık kaynağının belirli bir dalga boyu aralığında büyük miktarda uyarma ışığı sağlayabilmesi olduğu, böylece numunedeki floresan maddelerin gerekli uyarma ışığı yoğunluğunu elde edebildiği görülebilir. Aynı zamanda floresans mikroskoplarının uygun filtre sistemlerine sahip olması gerekir. Floresan mikroskobu, floresans doku kimyasında temel bir araçtır. Ultra-yüksek voltajlı ışık kaynağı, bir filtre sistemi (uyarma ve bastırma filtre plakaları dahil), bir optik sistem ve bir fotoğraf sistemi gibi ana bileşenlerden oluşur. Numuneyi uyarmak ve floresans yaymak için belirli bir dalga boyundaki ışığı kullanır.
1. Floresan uyarma yöntemleri: Işığın dalga boyu aralığına göre iki tür vardır: UV uyarma yöntemi (ultraviyole aydınlatma kullanılarak) ve BV uyarılma yöntemi (mavi mor ışık kullanılarak). UV uyarma yöntemi, uyarma için 400 nm'den kısa ultraviyole yakın ışık kullanır. Bu yöntem görünür uyarma ışığına sahip değildir, bu nedenle gözlemlenen floresans, boyanın doğal floresansını sergileyerek numune üzerindeki spesifik floresansın arka plan dokusunun kendi floresansından ayırt edilmesini kolaylaştırır.
2. BV uyarma yöntemi: Ultraviyoleden 404 nm ve 434 nm'de merkezlenen mavi ışığa uyarımı içerir. Bu yöntem, numuneyi ışınlamak için mavi ışık kullanır, dolayısıyla floresan gözlem sisteminin kesme filtresinin, mavi ışığı tamamen engelleyebilen ve gerekli yeşil ve sarı floresanstan tamamen geçebilen bir filtre kullanması gerekir. Floresan antikor yöntemi için kullanılan floresan pigmentler. Uyarma ışığının maksimum absorpsiyon dalga boyu ve floresansın maksimum emisyon dalga boyu nispeten yakındır, bu nedenle BV uyarma yönteminde kullanılan filtrenin keskin kesimli bir filtre kullanması gerekir. Bu yöntem, uyarma ışığı olarak mavi ışığı kullanabilir, böylece floresan pigmentlerin emme verimliliği yüksektir ve daha parlak görüntüler elde edilebilir. Dezavantajı ise 500 nm'nin altındaki floresansın görülememesi, 500 nm'nin üzerindeki floresansın ise tüm görüntünün sarı görünmesine neden olmasıdır. Floresan antikor yönteminde özgüllük çoğunlukla floresan pigmentlere özgü renk tarafından belirlenir, bu nedenle ince özgüllük tartışılırken yukarıda bahsedilen BV uyarma yönteminin dezavantajları genellikle önemli bir etkiye sahiptir.
