Hücre araştırması için mikroskopi sınıflandırması ve çalışma prensibi
Mikroskop, hücreleri gözlemlemek için birincil araçtır. Farklı ışık kaynaklarına göre iki kategoriye ayrılabilir: optik mikroskoplar ve elektron mikroskopları. İlki, ışık kaynağı olarak görünür ışığı (UV mikroskopları ultraviyole ışığı kullanır), ikincisi ise ışık kaynağı olarak elektron ışınlarını kullanır.
-,Optik mikroskop
(1) Sıradan optik mikroskop
Sıradan biyolojik mikroskoplar üç bölümden oluşur: ① ışık kaynağı ve kondansatör dahil olmak üzere aydınlatma sistemi; ② Mikroskobun ana gövdesi olan objektif lens ve okülerden oluşan optik büyütme sistemi. Küresel sapmayı ve renk sapmasını ortadan kaldırmak için, hem mercek hem de objektif ③Mekanik cihaz, malzemeyi sabitlemek ve gözlemi kolaylaştırmak için kullanılır (Şekil 2-1).
Mikroskop görüntüsünün net olup olmadığı sadece büyütme ile belirlenmez, aynı zamanda mikroskobun çözünürlüğü ile de ilgilidir. Çözünürlük, mikroskobun (veya insan gözünün hedeften 25 cm uzakta olması) nesneler arasındaki en küçük mesafeyi ayırt etme yeteneğini ifade eder. Çözünürlüğün boyutu, ışığın dalga boyu ve açıklık oranı ile ortamın kırılma indisi aşağıdaki formülle ifade edilir:
Formülde: n=ortamın kırılma indisi;=açıklık açısı (nesnel lens açıklığına numunenin açılma açısı), NA=lens açıklığı (sayısal açıklık). Mercek açısı her zaman 180 dereceden küçüktür, bu nedenle sina/2'nin maksimum değeri 1'den küçük olmalıdır.
Optik merceği yapmak için kullanılan camın kırılma indeksi 1,65 ila 1,78'dir ve kullanılan ortamın kırılma indeksi cama ne kadar yakınsa o kadar iyidir. Kuru objektif lensler için ortam havadır ve lens açıklık oranı genellikle 0.05 ila 0,95'tir; yağlı lensler için ortam olarak sedir yağı kullanılır ve lens açıklık oranı 1,5'e yakın olabilir.
Sıradan ışığın dalga boyu {{0}}nm'dir, dolayısıyla mikroskobun çözünürlük değeri 0,2μm'den az olmayacaktır ve insan gözünün çözünürlüğü 0,2 mm'dir, yani genel mikroskop tasarımının maksimum büyütmesi genellikle 1000X'tir.
(2) Floresan mikroskopisi
Klorofil gibi hücrelerdeki bazı maddeler ultraviyole ışınlarıyla ışınlandıktan sonra floresan olabilir; bazı maddelerin kendileri flüoresan yaymazlar, ancak flüoresan boyalar veya flüoresan antikorlarla boyanırlarsa, ultraviyole ışınlarıyla ışınlandıklarında da flüoresan yapabilirler ve flüoresans mikroskobu (Şekil 2-2, 3, 4) araçlardan biridir. bu tür maddeler üzerinde kalitatif ve kantitatif araştırmalar için.
Floresan mikroskoplar ve sıradan mikroskoplar aşağıdaki farklılıklara sahiptir:
1. Aydınlatma yöntemi genellikle epi-aydınlatmadır, yani ışık kaynağı, objektif merceğinden numune üzerine yansıtılır (Şekil 2-3);
2. Işık kaynağı ultraviyole ışıktır, dalga boyu daha kısadır ve çözünürlük sıradan mikroskoplardan daha yüksektir;
3. İki özel filtre vardır, ışık kaynağının önündeki filtre görünür ışığı filtrelemek için kullanılır ve mercek ile objektif merceği arasındaki filtre, gözleri korumak için ultraviyole ışığı filtrelemek için kullanılır.
(3) Lazer taramalı konfokal mikroskop
Lazer konfokal tarama mikroskobu (lazer konfokal tarama mikroskobu, Şekil 2-5, 6), tarama ışık kaynağı olarak lazeri kullanır ve görüntülemeyi nokta nokta, satır satır, yüzey yüzey tarar ve tarama lazeri ve floresan koleksiyonu aynı objektif merceği ve objektif merceğin odak noktası Tarama lazerinin odak noktası aynı zamanda anlık görüntülemenin nesne noktasıdır. Lazer ışınının dalga boyu kısa ve ışın çok ince olduğundan, konfokal lazer tarama mikroskobu, sıradan bir optik mikroskobun yaklaşık 3 katı olan daha yüksek bir çözünürlüğe sahiptir. Sistem bir kez odaklanır ve tarama örneğin bir düzlemi ile sınırlıdır. Odaklama derinliği farklı olduğunda, numunenin farklı derinlik seviyelerinin görüntüleri elde edilebilir. Bu görüntü bilgileri bilgisayarda saklanır. Bilgisayar analizi ve simülasyon yoluyla hücre örneğinin üç boyutlu yapısı görüntülenebilir.
Konfokal lazer tarama mikroskobu yalnızca hücre morfolojisini gözlemlemek için değil, aynı zamanda hücre içi biyokimyasal bileşenlerin kantitatif analizi, optik yoğunluk istatistikleri ve hücre morfolojisinin ölçümü için de kullanılabilir.
(4) Karanlık alan mikroskobu
Karanlık alan mikroskobu (karanlık alan mikroskobu, Şekil 2-7), kondansatörün merkezinde bir ışık tabakasına sahiptir, böylece aydınlatma ışığı doğrudan insan merceğine girmez ve yalnızca örnek tarafından yansıtılan ve kırılan ışık objektif merceğe girmesine izin verilir, bu nedenle görüş alanının arka planı siyahtır, nesnelerin kenarları parlaktır. Bu mikroskop kullanılarak, 4-200nm kadar küçük parçacıklar görülebilir ve çözünürlük, sıradan mikroskoplardan 50 kat daha yüksek olabilir.
(5) Faz kontrast mikroskobu
P. Zernike tarafından fazkontrast mikroskobu (faz kontrast mikroskobu, Şekil 2-8, 9) 1932'de icat edildi ve bunun için 1953'te Nobel Fizik Ödülü kazandı. Bu mikroskobun en büyük özelliği boyanmamış numuneleri ve canlı hücreleri gözlemleyebilmesidir.
Faz kontrast mikroskobunun temel prensibi, numuneden geçen görünür ışığın optik yol farkını bir genlik farkına dönüştürmek, böylece çeşitli yapılar arasındaki kontrastı iyileştirmek ve çeşitli yapıları açıkça görünür kılmaktır. Numuneden geçtikten sonra ışık kırılır, orijinal optik yolundan sapar ve 1/4λ (dalga boyu) kadar geciktirilir. Genişliği güçlendirin, artırın veya azaltın, kontrastı artırın. Yapısal olarak faz kontrast mikroskopları, sıradan optik mikroskoplardan farklı iki özel özelliğe sahiptir:
1. Halka şeklindeki diyafram, ışık kaynağı ile kondansatör arasında bulunur ve işlevi, kondansatörden geçen ışığın içi boş bir ışık konisi oluşturmasını ve numuneye odaklanmasını sağlamaktır.
2. Faz plakası (halka şeklindeki faz plakası), objektif merceğinde, doğrudan ışığın veya kırılan ışığın fazını 1/4λ geciktirebilen magnezyum florür ile kaplı bir faz plakası ekler. İki tip var:
①A artı faz plakası: Direkt ışık 1/4λ kadar geciktirilir. İki ışık dalgası grubu birleştirildikten sonra ışık dalgaları toplanır ve genlik artar. Numunenin yapısı, çevreleyen ortamdan daha parlaktır ve parlak bir kontrast (veya negatif kontrast) oluşturur.
② B artı faz plakası: Kırılan ışık 1/4λ kadar geciktirilir. İki ışın seti birleştirildikten sonra, ışık dalgaları çıkarılır ve genlik küçülerek karanlık bir kontrast (veya pozitif kontrast) oluşturur ve yapı çevreleyen ortamdan daha koyu olur.
(6) Polarizasyon mikroskobu
Polarize mikroskop, filamentler, iğler, kollajen, kromozomlar ve benzeri gibi çift kırılma özelliğine sahip maddeleri tespit etmek için kullanılır. Sıradan mikroskoplardan farkı, ışık kaynağının önünde bir polarizör (polarizör) bulunması, böylece mikroskoba giren ışığın polarize ışık olması ve içinde bir analizör (polarizasyon yönü polarizöre dik olan bir polarizör) bulunmasıdır. mercek namlusu. Bu mikroskobun aşaması döndürülebilir. Sahneye tek kırılmalı bir madde yerleştirildiğinde, sahne nasıl döndürülürse döndürülsün, iki polarizör dikey olduğundan mikroskopta ışık görülmez ve ışık mikroskopta görünmez. Çift kırılımlı malzemelere girerken, dönen sahne bu tür nesneleri algılayabilir çünkü ışık bu tür malzemelerden geçerken saptırılır.
