Lazer Konfokal Mikroskopi - Özellikler ve Uygulamalar
Lazer taramalı eş odaklı mikroskopi (LSCM), eşlenik odaklama teknolojisine dayalı olarak tasarlanmış bir mikroskop türüdür; yani lazer ışık kaynağı, ölçülecek numune ve dedektörün tümü birbiriyle eşlenik konumlardadır.
Esas
Genel bir mikroskopta, gözlem görüntü düzlemi, objektif merceğin odak düzleminin dedektör ile çakıştırılmasıyla bitişik eksenel düzlemden izole edilirken, eş odaklı bir mikroskopta, numuneyi ve A'yı aydınlatmak için kırınımı sınırlı bir ışık noktası kullanılır. Bu izolasyon etkisini yaratmak ve böylece çözünürlüğü artırmak amacıyla başıboş ışığı filtrelemek için ışık noktasının eşlenik odağında toplanan ışık yolunda iğne deliği kullanılır.
Görüntüleme özellikleri
Optik kesit taramalı görüntüleme
Lazer taramalı konfokal mikroskopinin bir diğer özelliği de taramalı görüntüleme teknolojisi olmasıdır. Geleneksel geniş alan aydınlatma teknolojisi numunenin tamamını aydınlatır, böylece görüntü doğrudan çıplak gözle veya bir dedektörle yakalanabilir, ancak LSCM, tarama ve görüntü için numunenin içinden geçen bir ışın veya Çoklu odaklanmış ışınlar kullanır. Ortaya çıkan görüntüye optik bölüm adı verilir. Aşağıda geleneksel geniş alan aydınlatma yöntemi ile lazer taramalı eş odaklı aydınlatma yöntemi arasındaki fark gösterilmektedir.
Bu nedenle, modern bir eş odaklı mikroskobun gerçek çalışma yöntemi aşağıdaki şekilde gösterildiği gibidir. Lazer tarafından yayılan uyarım ışığı dikroik bir aynadan geçer ve bir çift galvanometre aracılığıyla numunenin x ve y yönünde taranır. Numunenin uyarılması (veya yansıması) Işık, iğne deliğinden PMT dedektörüne girer ve kaydedilir ve kaydedilen taranmış görüntü, gerçek örnek görüntüyü yeniden oluşturmak için bir bilgisayar tarafından yeniden oluşturulur.
Farklı odak düzlemlerinde "z yığını" görüntüler oluşturun
Toplama ışık yolundaki küçük delikten yalnızca birleşik numune katmanından geri yansıyan ışık geçebilir ve geri kalan alakasız numune katmanı yansımaları küçük delik tarafından engellenir. Bu, önemli çözünürlük iyileştirmelerine yol açabilir. Aynı kalın numunenin çok boyutlu floresan mikroskobu ve konfokal mikroskopisinin yan yana karşılaştırılması. Farklı odak düzlemlerinde bir dizi görüntü alındığında, genellikle "z yığınları" olarak adlandırılan görüntüler oluşturulabilir; bu görüntüler, eş odaklı mikroskopi tarafından sunulan çözünürlük ve kontrast kazanımlarını ve bu kazanımların altında yatan nedenleri gösterir. Görüntüleme düzlemi doku üzerinde olacak şekilde yığının tepesindeki görüntü incelendiğinde, floresans görüntüsünde büyük miktarda dağınık ışık ortaya çıkarken, konfokal mikroskopi görüntüsünün siyah göründüğü görülebilir. Eksenel PSF'deki bu azalma doğrudan z yığınının ortasındaki optik arayüzde gözlemlenen çözünürlük farkına neden olur.
Çözünürlük, geniş alan aydınlatmasına kıyasla büyük ölçüde geliştirildi
Floresan mikroskobunda, tek bir noktadan yayılan ışık yoğunluğu nokta yayılım fonksiyonu (PSF) ile tanımlanır ve deseni bir Airy disktir. Floresan sisteminin çözünürlüğü Airy diskinin yarıçapı ile açıklanabilir; bu da şu şekilde tanımlanabilir: Objektif merceğin sayısal açıklığı ve uyarım ışığının dalga boyu belirlenir.
