Sıradan Mikroskop ve Floresan Mikroskop Arasındaki Fark
Floresan mikroskoplar, incelenecek nesneyi ışınlamak için bir ışık kaynağı olarak ultraviyole ışığı kullanır, böylece nesne ışık yayar ve ardından nesneyi mikroskop altında gözlemler. Esas olarak immünofloresan hücreler için kullanılır. Esas olarak bir ışık kaynağı, bir filtre plakası sistemi ve okülerin ve objektif merceğin büyütülmesi yoluyla numunenin flüoresan görüntüsünü gözlemlemek için bir optik sistemden oluşur. Bu floresan mikroskobu ile sıradan bir optik mikroskop arasındaki farka bir göz atalım.
1. Aydınlatma yöntemleri açısından
Floresan mikroskobunun aydınlatma yöntemi genellikle episkopiktir, yani ışık kaynağı, objektif mercek aracılığıyla test numunesi üzerine yansıtılır.
2. Çözünürlük açısından
Floresan mikroskoplar, ışık kaynağı olarak ultraviyole ışığı kullanır. Dalga boyu nispeten kısadır, ancak çözünürlük sıradan optik mikroskoplardan daha yüksektir.
3. Filtredeki fark
Floresan mikroskobu, görünür ışığı filtrelemek için ışık kaynağının önünde kullanılan ve insan gözünü koruyabilen ultraviyole ışığı filtrelemek için objektif lens ile oküler arasında kullanılan iki özel filtre kullanır.
Floresan mikroskobu aynı zamanda bir tür optik mikroskoptur, çünkü esas olarak floresan mikroskobu tarafından uyarılan dalga boyu kısadır, bu nedenle bu, floresan mikroskobu ile sıradan mikroskop arasında yapı ve kullanım farklılığına yol açar. Floresan mikroskoplarının çoğu, zayıf ışığı yakalama konusunda iyi bir işleve sahiptir, bu nedenle son derece zayıf floresan altında, görüntüleme yeteneği de iyidir. Son yıllarda floresan mikroskopların sürekli gelişmesiyle birleştiğinde, gürültü de büyük ölçüde azaltıldı. Bu nedenle, giderek daha fazla floresan mikroskop kullanılmaktadır.
İki fotonlu floresan mikroskopi hakkında bilgi
İki fotonlu uyarımın temel ilkesi şudur: yüksek foton yoğunluğu durumunda, flüoresan moleküller aynı anda iki uzun dalga boyuna sahip fotonu emebilir ve kısa bir sözde uyarılmış durum ömrü süresinden sonra daha kısa dalga boyuna sahip bir foton yayabilir. . ; etki, bir flüoresan molekülü uyarmak için dalga boyu uzun dalga boyunun yarısı olan bir foton kullanmakla aynıdır. İki fotonlu uyarım, yüksek bir foton yoğunluğu gerektirir. Hücrelere zarar vermemek için iki fotonlu mikroskopi, yüksek enerjili mod kilitli darbeli lazerler kullanır. Bu lazer tarafından yayılan lazer yüksek tepe enerjisine ve düşük ortalama enerjiye sahiptir, darbe genişliği sadece 100 femtosaniyedir ve frekansı 80 ila 100 megahertz'e ulaşabilir. Darbeli lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal açıklıklı bir objektif lens kullanırken, objektif merceğin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki fotonlu uyarım yalnızca objektif merceğin odak noktasında meydana gelir, yani iki foton mikroskobu, Floresan algılama verimliliğini artıran konfokal bir iğne deliğine ihtiyaç duymaz.
Genel floresan fenomeninde, uyarma ışığının düşük foton yoğunluğu nedeniyle, bir floresan molekülü aynı anda yalnızca bir fotonu emebilir ve ardından tek fotonlu floresan olan ışınımsal bir geçiş yoluyla bir floresan foton yayabilir. Işık kaynağı olarak lazer kullanan floresan uyarma işlemi için, iki fotonlu ve hatta çoklu fotonlu floresan oluşabilir. Şu anda, kullanılan uyarma ışık kaynağının yoğunluğu yüksektir ve foton yoğunluğu, aynı anda iki fotonu emen floresan moleküllerinin gereksinimlerini karşılar. Uyarma ışık kaynağı olarak genel bir lazer kullanma sürecinde, foton yoğunluğu, iki foton soğurma fenomenini üretmek için hala yeterli değildir. Genellikle bir femtosaniye darbeli lazer kullanılır ve anlık gücü megavat mertebesine ulaşabilir. Bu nedenle, iki fotonlu floresansın dalga boyu, uyarma dalga boyunun yarısında uyarma tarafından üretilen etkiye eşdeğer olan uyarma ışığının dalga boyundan daha kısadır.
İki fotonlu floresan mikroskobunun birçok avantajı vardır:
1) Uzun dalga boylu ışık, saçılmadan kısa dalga boylu ışığa göre daha az etkilenir ve numuneye kolayca nüfuz eder;
2) Odak düzlemi dışındaki flüoresan moleküller uyarılmaz, böylece daha fazla uyarma ışığı odak düzlemine ulaşabilir, böylece uyarma ışığı daha derin numunelere nüfuz edebilir;
3) Uzun dalga boylu yakın kızılötesi ışık, hücreler için kısa dalga boylu ışığa göre daha az toksiktir;
4) Numuneleri gözlemlemek için iki fotonlu bir mikroskop kullanırken, ışıkla ağartma ve fototoksisite yalnızca odak düzleminde meydana gelir. Bu nedenle, iki fotonlu mikroskopi, kalın numuneleri gözlemlemek, canlı hücreleri gözlemlemek veya spot ışıkla ağartma deneyleri için tek fotonlu mikroskopiden daha uygundur.
Konfokal floresan mikroskopi hakkında bilgi
Konfokal floresan mikroskobunun temel prensibi: numuneyi ışınlamak için bir nokta ışık kaynağı kullanılır ve odak düzleminde iyi tanımlanmış küçük bir ışık noktası oluşturulur. bölücülerden oluşur. Işın ayırıcı, floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Işık kaynağının ve dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne deliği ve algılama iğne deliği olarak adlandırılan bir iğne deliği vardır. İkisinin geometrik boyutu aynıdır, yaklaşık 100-200nm; odak düzlemindeki ışık noktasına göre, ikisi eşleniktir, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve son olarak aynı anda aydınlatma iğne deliğine ve algılama iğne deliğine odaklanabilir. Bu şekilde, odak düzleminden gelen ışık, algılama deliği kapsamında birleştirilebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından saçılan ışık, algılama deliğinin dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Lazer, numuneyi nokta nokta tarar ve iğne deliğini tespit ettikten sonra foto çoğaltıcı tüp, aynı zamanda, dijital bir sinyale dönüştürülen ve bilgisayara iletilen ve son olarak net bir şekilde toplanan ilgili ışık noktasının nokta nokta konfokal görüntüsünü elde eder. ekranda tüm odak düzleminin konfokal görüntüsü.
Her odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir. Optik ince kesit olarak da bilinen bu optik kesit her zaman belirli bir kalınlığa sahiptir. Odak noktasındaki ışık yoğunluğu odak olmayan noktadakinden çok daha büyük olduğundan ve odak dışı düzlem ışığı iğne deliği tarafından filtrelendiğinden, konfokal sistemin alan derinliği yaklaşık olarak sıfırdır ve Z boyunca tarama yapar. -eksen, numunenin odaklanmış noktasında iki boyutlu optik bölümü gözlemleyerek optik tomografiyi gerçekleştirebilir. XY düzlemi (odak düzlemi) taraması ile Z ekseni (optik eksen) taraması birleştirildiğinde, sürekli katmanların iki boyutlu görüntülerinin biriktirilmesiyle numunenin üç boyutlu görüntüsü elde edilebilir ve özel bilgisayar yazılımı ile işlenebilir.
Yani, algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliği her zaman aynı noktaya odaklanır, böylece odak düzleminin dışında uyarılan flüoresan tespit iğne deliğine giremez.
Lazer konfokal çalışma prensibinin basit ifadesi, ışık kaynağı olarak lazer kullanması ve geleneksel floresan mikroskop görüntüleme temelinde, bir lazer tarama cihazı ve bir eşlenik odaklama cihazı eklemesi ve dijital görüntü elde etmek için bir sistem olmasıdır. bilgisayar kontrolü ile işleme.
