(İki foton, konfokal) floresan mikroskobu ve sıradan mikroskop arasındaki fark
İki foton uyarmanın temel prensibi, yüksek foton yoğunluğunda, floresan moleküllerin aynı anda iki uzun dalga boyu fotonu emebilmesi ve kısa bir süre sonra uyarılmış durum ömrüden sonra daha kısa bir dalga boyu foton yayabilmesidir; Etki, floresan molekülleri uyarmak için uzun dalga boyunun yarısının uzun dalga boyunun yarısına sahip bir foton kullanmakla aynıdır. İki foton uyarımı yüksek bir foton yoğunluğu gerektirir ve hücrelere zarar vermekten kaçınmak için iki foton mikroskopi yüksek enerjili mod kilitli darbe lazerleri kullanır. Bu lazer tarafından yayılan lazer, sadece 100 femtosaniye nabız genişliği ve 80 ila 100 megahertz frekansı ile yüksek tepe enerjisine ve düşük ortalama enerjiye sahiptir. Darbeli bir lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal diyafram objektif lens kullanıldığında, objektif lensin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki foton uyarma sadece objektif merceğin odak noktasında gerçekleşir. Bu nedenle, iki foton mikroskobu, floresan tespitinin etkinliğini artıran bir konfokal iğne deliği gerektirmez.
Genel floresan fenomenlerinde, uyarma ışığının düşük foton yoğunluğu nedeniyle, bir floresan molekül bir seferde sadece bir fotonu emebilir ve daha sonra tek foton floresan olarak bilinen radyasyon geçişinden başka bir floresan fotonu yayabilir. Lazer kullanan floresan uyarma işlemleri için ışık kaynakları olarak, iki foton veya hatta çok foton floresan fenomenleri meydana gelebilir. Bu durumda, kullanılan uyarma ışığı kaynağı, floresan moleküllerin aynı anda iki fotonu emmesi gerekliliğini karşılayan yüksek yoğunluk ve foton yoğunluğuna sahiptir. Uyarma ışığı kaynağı olarak genel bir lazer kullanma sürecinde, foton yoğunluğu iki foton emilim fenomeni üretmek için hala yetersizdir. Tipik olarak, femtosaniye darbe lazerleri kullanılır, anlık güç megawatt seviyesine ulaşır. Bu nedenle, iki foton floresansın dalga boyu, yarı uyarma dalga boyu uyarımı ile üretilen etkiye eşdeğer olan uyarma ışığından daha kısadır.
Konfokal floresan mikroskopisi ile ilgili bilgi
Konfokal floresan mikroskopisinin temel prensibi, örneği ışınlamak için bir nokta ışık kaynağı kullanmaktır ve odak düzleminde iyi tanımlanmış küçük bir ışık noktası oluşturmaktır. Işınlamadan sonra bu noktadan yayılan floresan, objektif lens tarafından toplanır ve orijinal ışınlama yolu boyunca bir dikroik aynadan oluşan ışın ayırıcısına geri gönderilir. Spektrometre doğrudan dedektöre floresan gönderir. Hem ışık kaynağının hem de dedektörün önünde, sırasıyla aydınlatma iğnesi ve algılama iğnesi adı verilen bir iğne deliği vardır. İkisinin geometrik boyutları tutarlıdır, yaklaşık 100-200 nm; Odak düzlemindeki ışık noktasıyla karşılaştırıldığında, ikisi konjugattır, yani ışık nokta bir dizi lensten geçer ve sonuçta hem aydınlatma iğnesi hem de algılama pinholuna eşzamanlı olarak odaklanabilir. Bu şekilde, odak düzleminden gelen ışık, algılama deliği aralığında birleşebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından dağılmış ışık algılama deliğinin dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Numuneyi bir lazerle noktaya kadar tarayan fotomultiplier tüpü, iğne deliğini tespit ettikten sonra, ışık noktasının karşılık gelen konfokal görüntüsünü noktaya alır, dijital sinyale dönüştürür ve bilgisayara iletir ve son olarak ekrandaki tüm odak düzleminin net bir konfokal görüntüsüne toplanır.
