Mikroskopla mikroorganizmaların doğrudan sayılması
Deneysel prensip
Hemasitometre kullanılarak mikroskop altında doğrudan sayım, yaygın olarak kullanılan bir mikrobiyal sayma yöntemidir. Bu yöntemin avantajı sezgisel ve hızlı olmasıdır. Uygun şekilde seyreltilmiş bakteri süspansiyonunu (veya spor süspansiyonunu) slayt ile hemasitometrenin kapak camı arasındaki sayım bölmesine yerleştirin ve mikroskop altında sayın. Sayma odasının hacmi sabit (0.1mm2) olduğundan mikroskop altında gözlenen mikroorganizma sayısına göre birim hacim başına düşen toplam mikroorganizma sayısına dönüştürülebilmektedir. Bu yöntem canlı ve ölü bakterilerin toplamını saydığından toplam bakteri sayımı yöntemi olarak da adlandırılır.
Bir hemasitometre genellikle üzerinde dört oluğun üç platform oluşturduğu özel bir cam slayttır. Ortadaki platform kısa yatay bir oyukla ikiye bölünmüştür. Platformun her iki tarafına bir ızgara kazınmıştır. Her ızgara dokuz büyük kareye bölünmüştür. Ortadaki büyük kare sayım odasıdır. Sayım odasında mikroorganizmalar sayılır. Kan hücresi sayma panosunun yapısı Şekil Ⅷ-1'da gösterilmektedir.
Sayım odasının ölçeğinin genel olarak iki özelliği vardır; birincisi, büyük bir karenin ortadaki 16 kareye bölünmesi ve her orta karenin 25 küçük kareye bölünmesidir (Şekil Ⅷ-2); diğeri ise büyük bir kare. Kare ortadaki 25 kareye ve her orta kare 16 küçük kareye bölünmüştür (Şekil Ⅷ-1, C). Ancak ne tür bir sayma tahtası olursa olsun, Şekil Ⅷ-2'da gösterildiği gibi her büyük karedeki küçük karelerin sayısı aynıdır, yani 16×25=400 küçük kare.
Her büyük karenin kenar uzunluğu 1 mm, her büyük karenin alanı 1 mm2'dir. Kapak camı kaplandıktan sonra kayar cam ile kapak camı arasındaki yükseklik 0,1 mm olur, dolayısıyla sayma bölmesinin hacmi 0,1 mm3 olur.
Sayarken, genellikle ortadaki beş ızgaradaki toplam bakteri sayısını sayın, ardından her bir orta ızgaranın ortalama değerini elde edin ve ardından büyük bir ızgaradaki toplam bakteri sayısını elde etmek için 16 veya 25 ile çarpın ve ardından şuna dönüştürülür: 1 ml bakteri çözeltisindeki toplam bakteri sayısı.
Laboratuvar ekipmanları
Hemositometre, mikroskop, lamel, steril kılcal;
Deneysel Malzemeler
Saccharomyces cerevisiae süspansiyonu
Deneysel prosedür (mikrobiyal mikroskop doğrudan sayma yöntemi)
1. seyreltme
Saccharomyces cerevisiae süspansiyonunu uygun şekilde seyreltin. Bakteriyel solüsyon kalın değilse seyreltilmesine gerek yoktur.
2. Mikroskobik sayma odası
Numuneleri eklemeden önce sayma plakasının sayma bölmesinde mikroskobik inceleme yapın. Kir varsa saymadan önce temizlenmesi gerekir.
3. örnek ekleyin
Temiz ve kuru hemasitometre plakasını bir kapak camıyla kapatın ve ardından steril ince ağızlı bir damlalık kullanarak seyreltilmiş Saccharomyces cerevisiae çözeltisinden küçük bir damlayı kapak camının kenarından (çok fazla değil) damlatın, böylece bakteri çözeltisi boşluk boyunca boşluğa yakındır. Kılcal ozmoz sayma odasına kendiliğinden girer ve genel sayma odası bakteriyel sıvı ile doldurulabilir. Hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin.
4. mikroskop sayımı
5 dakika dinlendikten sonra hemasitometreyi mikroskop tablasına yerleştirin, önce sayma odasının yerini bulmak için düşük güçlü bir lens kullanın ve ardından sayma için yüksek güçlü bir lense geçin. Sayım öncesinde bakteriyel solüsyonun çok kalın veya çok ince olduğu tespit edilirse, saymadan önce seyreltmenin yeniden ayarlanması gerekir. Genel olarak numune seyreltmesi her hücrede yaklaşık 5-10 bakteri gerektirir. Her sayma odası, sayım için 5 orta ızgaradaki (isteğe bağlı 4 köşe ve merkezi ızgara) bakterileri seçer. Izgara çizgisindeki bakteriler genellikle yalnızca üst ve sağ satırlarda sayılır. Maya tomurcuklanması durumunda, tomurcuk gövdesinin büyüklüğü ana hücrenin yarısına ulaştığında iki bakteri sayın. İki sayım odasında sayılan değerlerden numunenin bakteri içeriğini hesaplamak için bir numuneyi sayın.
5. Hemositometrenin Temizlenmesi
Kullandıktan sonra musluk üzerindeki kan hücresi sayma plakasını su jeti ile durulayın, sert cisimlerle yıkamayın, yıkadıktan sonra kendiniz veya saç kurutma makinesi ile kurutun. Mikroskobik incelemede, her hücrede artık bakteri veya başka çökeltilerin olup olmadığı gözlemlenir. Temiz değilse temizlenene kadar defalarca yıkanması gerekir.
