Mikroorganizmaların sayısının belirlenmesi - mikroskobun doğrudan sayma yöntemi!
Bakteri popülasyonunun büyümesi, hücre sayısındaki artış veya hücre kütlesindeki artışla kendini gösterir. Hücre sayısını belirleme yöntemleri, doğrudan mikroskop sayma yöntemi, plaka koloni sayma yöntemi, fotoelektrik yağ oranı yöntemi, maksimum olasılık yöntemi ve membran filtrasyon yöntemini içerir. Hücre maddesini ölçme yöntemleri, hücre kuru ağırlığının belirlenmesini, nitrojen, RNA ve DNA içeriği gibi belirli hücresel bileşenlerin belirlenmesini ve metabolitlerin belirlenmesini içerir. Kısacası, mikroorganizmaların büyümesini ölçmek için her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip birçok yöntem vardır ve spesifik duruma göre seçilmelidir. Bu deney esas olarak üretim ve bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan mikroskop doğrudan sayma yöntemini tanıtmaktadır.
1. Amaç Gereksinimleri
1. Kan hücresi sayımı ilkesini netleştirin.
2. Bir kan hücresi sayacı kullanarak mikroorganizmaları sayma yönteminde ustalaşın.
2. Temel ilkeler
Mikroskop doğrudan sayım yöntemi, belirli bir alan ve hacme sahip (bakteri sayacı olarak da bilinir) özel bir cam lam üzerinde test edilecek numunenin az miktardaki süspansiyonunu doğrudan saymak için basit, hızlı ve sezgisel bir yöntemdir. Yöntemler. Şu anda yurt içinde ve yurt dışında yaygın olarak kullanılan bakteri sayaçları şunlardır: kan hücresi sayma tahtası, Peteroff-Hauser bakteri sayacı ve Hawksley bakteri sayacı, vb. Maya, bakteri, küf sporları ve diğer süspansiyonların sayımı için kullanılabilirler ve temel prensip aynıdır. Son iki tip bakteri sayacı, bir lamel ile kaplandıktan sonra toplam hacmi 0.02mm3'tür ve lamel ile sürgü arasındaki mesafe yalnızca 0,02 mm'dir, dolayısıyla yağ Daldırma objektif lensi, bakteri gibi küçük hücreleri gözlemlemek ve gözlemlemek için kullanılabilir. saymak. Bu bakteriyometrelere ek olarak, genellikle sütün bakteriyolojik muayenesinde kullanılan smear alanının doğrudan mikroskop altında gözlenen görme alanı alanına oranı için bir tahmin yöntemi de vardır. Mikroskop doğrudan sayım yönteminin avantajları sezgisel, hızlı ve kullanımı kolaydır. Ancak bu yöntemin dezavantajı, ölçülen sonucun genellikle ölü ve canlı hücrelerin toplamı olmasıdır. Şu anda, bu eksikliğin üstesinden gelmek için, mikro oda kültürünü (kısa süreli) boyayan canlı bakterilerin kombinasyonu ve yalnızca canlı bakterileri sayma amacına ulaşmak için hücre bölünmesi inhibitörlerinin eklenmesi gibi bazı yöntemler vardır.
Bu deneyde, doğrudan mikroskobik sayım için bir örnek olarak bir hemasitometre kullanıldı. Diğer iki tip bakteri sayacının kullanımı için lütfen her bir üreticinin talimatlarına bakın. Hemositometre ile doğrudan mikroskop altında sayım, mikroorganizmaların sayılması için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Sayma plakası, üzerinde dört yarıktan oluşan üç platformun bulunduğu özel bir cam kaydıraktır; ortadaki daha geniş platform, kısa bir enine yarıkla ikiye bölünmüştür ve platformun her iki yanında bir ızgara vardır. Her ızgara dokuz büyük kareye bölünmüştür ve ortadaki büyük kare sayım odasıdır. Kan hücresi sayma plakasının yapısı Şekil l'de gösterilmiştir{{{{10}}}}. Sayım odası ölçeğinin genellikle iki özelliği vardır, biri 25 orta kareye bölünmüş büyük bir kare ve her orta kare 16 küçük kareye bölünmüştür (Şekil 15-2); diğeri büyük bir kare. Kare 16 orta kareye bölünmüştür ve her orta kare 25 küçük kareye bölünmüştür ama ne tür bir sayım tahtası olursa olsun her büyük karede 400 küçük kare vardır. Her büyük karenin kenar uzunluğu 1 mm ve her büyük karenin alanı 1 mm2'dir. Kapak camı ile kapatıldıktan sonra, kapak camı ile kayar cam arasındaki yükseklik 0,1 mm'dir, bu nedenle sayım odasının hacmi 0,1 mm3'tür (mililitrenin binde biri). Şekil 15-1 Kan hücresi sayma panosunun yapısı (1) Şekil 15-2 Kan hücresi sayma panosunun yapısı (2) A. Önden görünüm; B. Boyuna kesit görünüşü; Genişletilmiş ızgara, ortadaki büyük kare sayım odasıdır 1. Kan hücreleri Sayım plakası; 2. Kapak camı; 3. Sayım odasında sayarken, genellikle beş karedeki toplam bakteri sayısını sayın, ardından her karenin ortalamasını hesaplayın ve elde etmek için 25 veya 16 ile çarpın. 1 ml bakteri solüsyonundaki toplam bakteri sayısı. Beş karedeki toplam bakteri sayısı A ve bakteri solüsyonunun seyreltme oranı B olsun. 25 kareli bir sayım plakası ise, 1 mL bakteri solüsyonundaki toplam bakteri sayısı {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(adet) Benzer şekilde, 16 orta boy kareden oluşan bir sayı levhasıysa, 1 mL bakteri solüsyonundaki toplam bakteri sayısı=A/ 5×16×104×B=32000A·B (adet)
3. Ekipman
1. Bakteri
Saccharomyces cerevisiae
2. Aletler veya diğer gereçler
Hemositometre, mikroskop, lamel, steril kılcal damlalık.
4. İşlem adımları
1. Bakteri süspansiyonunun hazırlanması
Saccharomyces cerevisiae, steril fizyolojik tuzlu su ile uygun konsantrasyonda bir bakteriyel süspansiyon halinde hazırlandı.
2. Mikroskop sayım odası
Numuneleri eklemeden önce, sayma plakasının sayma odasını mikroskobik olarak inceleyin. Kir varsa saymadan önce temizlenmesi ve kurutulması gerekir.
3. Numune ekleyin
Temiz ve kuru hemasitometreyi bir lamel ile kapatın ve ardından steril bir kapiler damlalık kullanarak lamelin kenarından çalkalanmış Saccharomyces cerevisiae süspansiyonundan küçük bir damla damlatın ve bakteriyel solüsyonun kapiler ozmoz yoluyla boşluk boyunca otomatik olarak hareket etmesine izin verin. Sayım odasına girerken, genel sayım odası bakteriyel sıvı ile doldurulabilir. Örnek alırken, önce bakteri solüsyonunu çalkalayın; numune eklerken sayma odasında hava kabarcığı oluşmamalıdır.
4. Mikroskop sayımı
Numuneyi ekledikten sonra 5 dakika hareketsiz durun, ardından hemasitometreyi mikroskop aşamasına yerleştirin, önce düşük güçlü bir mikroskopla sayım odasının yerini bulun ve ardından sayım için yüksek güçlü bir mikroskoba geçin. Mikroskop ışığının yoğunluğunu uygun şekilde ayarlayın. Aydınlatma için ayna kullanan mikroskoplarda ışığın bir tarafından sapmamasına dikkat edilmelidir aksi halde görüş alanında sayım odasının kare çizgilerini net olarak görmek kolay olmayacak veya sadece dikey çizgiler veya yatay çizgiler yanacaktır. görüldü. Saymadan önce bakteri solüsyonunun çok konsantre veya çok seyreltilmiş olduğu bulunursa, saymadan önce seyreltmeyi yeniden ayarlamak gerekir. Genel olarak, numune seyreltme işlemi için her bir küçük hücrede yaklaşık 5 ila 10 bakteri gerekir. Her sayım odası, sayım için 5 orta hücre (isteğe bağlı 4 köşe ve merkezde bir orta hücre) seçer. Izgara çizgisinde bulunan hücreler genellikle sadece üst ve sağ çizgiler üzerinde sayılır. Maya tomurcuklanması durumunda, tomurcuğun boyutu ana hücrenin yarısına ulaştığında iki bakteri hücresi sayılır. Bir numuneyi saymak için, iki sayma odasından alınan ortalama değeri hesaplayarak numunenin bakteri içeriğini hesaplayın.
5. Kan hücresi sayımını yıkayın
Kullandıktan sonra kan hücresi sayma tahtasını musluk suyuyla durulayın, sert cisimlerle ovalamayın ve yıkadıktan sonra kendiniz veya saç kurutma makinesi ile kurutun. Her küçük hücrede kalıntı bakteri veya başka tortu olup olmadığını gözlemlemek için mikroskobik inceleme. Temiz değilse, temiz olana kadar defalarca yıkanmalıdır.
