Süper Çözünürlüklü Mikroskopinin Farklı Tekniklerinin Karşılaştırılması
Geleneksel ışık mikroskobu için ışığın kırınımı, görüntüleme çözünürlüğünü yaklaşık 250 nm ile sınırlar. Bugün, süper-çözünürlük teknikleri bunu 10 kattan fazla artırabilir. Bu teknik esas olarak üç yöntemle elde edilir: ışığa duyarlı yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) dahil olmak üzere tek moleküllü yerelleştirme mikroskobu; yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM); ve uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED). Süper çözünürlüklü teknolojinin nasıl seçileceği herkesin umursadığı şeydir. Birleşik Krallık Oxford Üniversitesi'nde doktora sonrası araştırmacı olan Mathew Stracy, "Ne yazık ki, hangi yöntemin kullanılacağına karar vermek için basit ilkeler yok" diyor. "Her birinin kendi avantajları ve dezavantajları var." Bilim adamları elbette belirli bir proje için doğru yöntemi nasıl seçeceklerini de çözüyorlar. "Biyogörüntüleme bağlamında dikkate alınması gereken temel faktörler şunları içerir: uzamsal ve zamansal çözünürlük, fotohasar duyarlılığı, etiketleme kapasitesi, numune kalınlığı ve arka plan floresansı veya hücre otolog Floresansı." Nasıl çalışır Çeşitli süper çözünürlüklü mikroskoplar farklı şekillerde çalışır. PALM ve STORM durumunda, belirli bir anda flüoresan işaretleyicilerin yalnızca küçük bir kısmı uyarılır veya ışıkla etkinleştirilir, bu da yüksek hassasiyetle bağımsız konumlarının belirlenmesini sağlar. Tüm flüoresan etiketlerle bu süreçten geçmek, eksiksiz bir süper çözünürlüklü görüntüyle sonuçlanır. 2014 Nobel Kimya Ödülü'nü kazananlardan biri ve Max Planck Biyofiziksel Kimya Enstitüsü'nün direktörü Stefan Hell şunları söyledi: "PALM/STORM sisteminin kurulumu nispeten kolaydır, ancak flüoresan olduğu için uygulanması zordur. grup fotoaktivasyon yeteneğine sahip olmalıdır. Sınırlamalar Dezavantajları, bir hücre bağlamında tek bir floresan molekülü algılamaya ihtiyaç duymaları ve STED'den daha az güvenilir olmalarıdır." STED, floroforu uyarmak için bir lazer darbesi ve floroforu söndürmek için halka şeklinde bir lazer kullanır ve süper çözünürlük için yalnızca ara nanometre boyutunda Floresan bırakır. Tüm örneğin taranması bir görüntü oluşturur. Hell, "STED'in avantajı, bir düğme teknolojisi olmasıdır," diye açıkladı. "Standart bir konfokal floresan mikroskobu gibi çalışıyor." Ayrıca yeşil veya sarı floresan proteinler ve rodamin türevli boyalar gibi floroforlar kullanarak canlı hücreleri görüntüleyebilir. Parametrik karşılaştırma Tüm süper çözünürlük teknikleri, çözünürlük açısından geleneksel ışık mikroskobunu geride bıraksa da, birbirlerinden farklıdırlar. SIM, çözünürlüğü kabaca ikiye katlayarak yaklaşık 100 nm'ye çıkarır. PALM ve STORM, 15 nm hedefleri çözebilir. Hell'e göre STED, canlı hücrelerde 30 nm ve sabit hücrelerde 15 nm'lik bir uzamsal çözünürlük sağlar. Belirli uygulamalar söz konusu olduğunda, sinyal-gürültü oranını da dikkate almalıyız. Bazı durumlarda, daha düşük çözünürlük ancak daha yüksek SNR, tersinden (daha yüksek çözünürlük ancak daha düşük SNR) daha iyi bir görüntü ile sonuçlanabilir. Görüntü alma hızı da özellikle canlı hücreler için çok önemlidir. Stracy, "Tüm süper çözünürlüklü teknikler, geleneksel floresan görüntüleme tekniklerinden daha yavaştır" dedi. "PALM/STORM en yavaş olanıdır, tek bir görüntü elde etmek için on binlerce kareye ihtiyaç duyar, SIM'in düzinelerce kareye ihtiyacı vardır ve STED bir tarama teknolojisidir, bu nedenle edinme hızı görüş alanının boyutuna bağlıdır." Canlı hücrelere veya sabit Görüntüleme hücrelerine ek olarak, bazı bilim adamları nesnelerin nasıl hareket ettiğini de anlamak isterler. Stracy, sadece statik görüntüleri değil, canlı hücrelerdeki biyolojik sistemlerin dinamiklerini anlamakla ilgileniyor. Canlı hücrelerdeki dinamikleri analiz etmek için PALM'yi tek parçacık izleme ile birleştiriyor. Bu şekilde, işaret moleküllerini görevlerini yerine getirirken doğrudan takip edebilir. Bununla birlikte, SIM'in bu dinamik süreçleri moleküler düzeyde incelemek için uygun olmadığına, ancak hızlı edinim hızı nedeniyle, tüm kromozomlar gibi daha büyük yapıların dinamiklerini gözlemlemek için özellikle uygun olduğuna inanıyor. En son sonuçlar 2017'de Hell's ekibi, Science dergisinde MINFLUX süper çözünürlüklü mikroskobu bildirdi. Hell'e göre, bu süper çözünürlük yöntemi ilk kez 1 nm'lik bir uzamsal çözünürlüğe ulaşıyor. Ayrıca canlı hücrelerdeki tek tek molekülleri diğer yöntemlere göre en az 100 kat daha hızlı takip edebiliyor. Diğer bilim adamları da MINFLUX mikroskobundan övgüyle söz ettiler. Shechtman, "Yeni uygulamalar ve yaklaşımlar sürekli olarak geliştiriliyor, ancak benim için iki gelişme öne çıkıyor" dedi. Biri MINFLUX'tur. "Çok hassas moleküler konumlandırma elde etmek için ustaca bir yaklaşım kullanıyor." İkinci heyecan verici gelişmeyle ilgili olarak Shechtman, WE Moerner ve Stanford Üniversitesi'ndeki meslektaşlarından bahsetti. Moerner aynı zamanda 2014 Nobel Kimya Ödülü'nü de aldı. Kazananlardan biri. Floresan tek moleküllerin anizotropik saçılmasının neden olduğu görüntüleme çözünürlüğü sınırlamasını ele almak için bilim adamları, moleküllerin yönünü ve konumunu belirlemek için farklı uyarma polarizasyonları kullandılar. Ek olarak, hassas gözbebeği yüzeyleri geliştirmişlerdir. Bu teknikler, yapıları yerelleştirme yeteneğini geliştirir. Floresan etiketler hakkında Birçok süper çözünürlüklü uygulamada etiketler gerçekten önemlidir. İlgili ürünleri sağlayan bazı şirketler de var. Örneğin, Alman Miltenyi, süper çözünürlüklü mikroskopi boyaları için özel antikor konjugasyon hizmetleri sağlamak üzere Stefan Hell tarafından kurulan bir şirket olan Abberior ile iş birliği yaptı. Bir dizi başka şirket de eşleşen işaretleyiciler sunar. ChromoTek pazarlama sorumlusu Christoph Eckert, "Nano-Güçlendiricilerimiz çok küçük, yalnızca 1,5 kDa ve son derece spesifik," diyor. Bu proteinler, yeşil ve kırmızı floresan proteinleri (GFP ve RFP) bağlar. VHH veya nanokorlar olarak bilinen alpaka antikor parçalarından türetilirler, mükemmel bağlanma özelliklerine ve partiden partiye değişiklik olmaksızın kararlı kaliteye sahiptirler. Bu işaretleyiciler, SIM, PALM, STORM ve STED gibi çeşitli süper çözünürlüklü teknikler için uygundur. Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde yardımcı doçent olan Ai-Hui Tang ve meslektaşları, sinir sistemindeki bilgi yayılımını keşfetmek için ChromoTek'in GFP-Booster ve STORM'unu kullandılar. Presinaptik ve postsinaptik nöronlarda nanokolon adı verilen moleküler nanokümeler buldular. Bilim adamları, bu yapının, merkezi sinir sisteminin sinaptik etkinliği korumak ve düzenlemek için basit ilkeler kullandığını gösterdiğine inanıyor. Süper çözünürlüklü görüntülemenin çeşitli versiyonları ve sayıları giderek artan yöntemler, bilim insanlarını biyolojik gizemlerin daha da derinlerine götürüyor. Biyologlar, görünür ışığın kırınım sınırını aşarak, hücrelerin hareketlerini "yakından izleyebilirler" bile.
