İki fotonlu floresans mikroskobunun birçok avantajı vardır:
1) Daha uzun dalga boylarındaki ışık, numuneye nüfuz etmek için daha kısa dalga boylarına göre saçılmadan daha az etkilenir;
(2) Odak düzleminin dışındaki floresan moleküller uyarılmaz, böylece daha fazla uyarım ışığı odak düzlemine ulaşabilir, böylece uyarım ışığı numunenin daha derinlerine nüfuz edebilir;
3) Yakın kızılötesi ışığın daha uzun dalga boyları, hücreler için daha kısa dalga boylarına göre daha az toksiktir;
4) Bir örneği gözlemlemek için iki fotonlu bir mikroskop kullanıldığında, ışıkla ağartma ve fototoksisite yalnızca odak düzleminde mevcuttur. Bu nedenle, iki fotonlu mikroskoplar, kalın örneklerin gözlemlenmesi, canlı hücrelerin gözlemlenmesi veya spot ışıkla ağartma deneylerinin yapılması için tek fotonlu mikroskoplardan daha uygundur.
Konfokal floresans mikroskobu bilgisi
Eş odaklı floresan mikroskobunun temel prensibi: numuneyi ışınlamak için odak düzleminde küçük, iyi tanımlanmış bir ışık noktası oluşturan bir nokta ışık kaynağı kullanılır. Işınlamadan sonra bu noktadan yayılan floresans, objektif mercek tarafından toplanır ve orijinal ışınlama ışık yolu boyunca iki yönlü kromatik aynadan oluşan ışın ayırıcıya geri gönderilir. Işın ayırıcı floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Hem ışık kaynağının hem de dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne deliği ve algılama iğne deliği adı verilen bir iğne deliği bulunur. Her ikisi de aynı geometriye sahiptir, yaklaşık 100-200 nm ve odak düzlemindeki ışık noktasına göre eşleniktirler, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve sonuçta hem aydınlatıcı hem de aydınlatıcı noktaya odaklanabilir. ve dedektör iğne delikleri. Bu şekilde, odak düzleminden gelen ışık, prob açıklığı içinde birleşebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından gelen saçılan ışık, prob açıklığının dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Lazer, numuneyi noktadan noktaya tarar ve iğne deliğini tespit ettikten sonra foto-çoğaltıcı tüp, aynı zamanda, dijital bir sinyale dönüştürülen ve bilgisayara iletilen ve sonunda net bir şekilde birleşen ilgili ışık noktasının eş odaklı görüntüsünü de elde eder. Ekrandaki tüm odak düzleminin eş odaklı görüntüsü.
Her odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir ve bu optik kesit her zaman optik tabaka olarak da bilinen belirli bir kalınlığa sahiptir. Odak noktasındaki ışık yoğunluğu odak dışı noktaya göre çok daha büyük olduğundan ve odak dışı düzlem ışığı iğne deliği tarafından filtrelendiğinden, eş odaklı sistemin alan derinliği sıfıra yaklaşır ve tarama yapılır. Z ekseni yönü boyunca optik tomografinin, odak noktasında gözlemlenecek numunenin iki boyutlu bir optik dilimini oluşturmasını sağlar. XY düzlemi (odak düzlemi) taramasını Z ekseni (optik eksen) taramayla birleştirerek, özel bilgisayar yazılımı tarafından işlenen iki boyutlu görüntülerin ardışık katmanlarının biriktirilmesiyle numunenin üç boyutlu bir görüntüsü elde edilebilir.
Bu, algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliğinin her zaman aynı noktaya odaklandığı, dolayısıyla odak düzleminin dışında uyarılan floresansın algılama iğne deliğine giremeyeceği anlamına gelir.
Lazer konfokalın çalışma prensibi basitçe, dijital görüntü elde etme ve işleme sistemini gerçekleştirmek için geleneksel floresans mikroskobu görüntüleme, ek lazer tarama cihazı ve konjuge odaklama cihazı temelinde, bilgisayar kontrolü yoluyla bir ışık kaynağı olarak lazer kullanması ifade edilir.
