Floresan Mikroskop ve Normal Mikroskop Arasındaki Fark
1. Aydınlatma yöntemine bakın
Floresan mikroskobunun aydınlatma yöntemi genellikle epi-tiptir, yani ışık kaynağı, objektif lens yoluyla test numunesi üzerine yerleştirilir.
2. Çözünürlüğe bakın
Floresan mikroskoplar, ışık kaynağı olarak nispeten kısa bir dalga boyuna sahip ultraviyole ışığı kullanır, ancak çözünürlük, sıradan optik mikroskoplardan daha yüksektir.
3, filtredeki fark
Floresan mikroskop, görünür ışığı filtrelemek için ışık kaynağının önünde kullanılan ve insan gözünü koruyabilen ultraviyole ışığı filtrelemek için objektif lens ile oküler arasında kullanılan iki özel filtre kullanır.
Floresan mikroskobu aynı zamanda bir tür optik mikroskoptur, çünkü esas olarak floresan mikroskobu tarafından uyarılan dalga boyu kısadır, bu nedenle bu, floresan mikroskobu ile sıradan mikroskobun yapısında ve kullanımında farklılığa yol açar. Floresan mikroskoplarının çoğu, zayıf ışığı yakalama konusunda iyi bir işleve sahiptir. , yani son derece zayıf floresan altında, görüntüleme yeteneği de iyidir. Son yıllarda floresan mikroskobunun sürekli gelişmesiyle birleştiğinde, gürültü de büyük ölçüde azaltıldı. Bu nedenle, giderek daha fazla floresan mikroskop kullanılmaktadır.
İki Fotonlu Floresans Mikroskobu Bilgisi
İki fotonlu uyarımın temel ilkesi şudur: yüksek foton yoğunluğu durumunda, flüoresan moleküller iki uzun dalga boyundaki fotonu aynı anda emebilir ve çok kısa sözde uyarılmış durum ömrünün ardından kısa dalga boyunda bir foton yayar. ; etki, bir flüoresan molekülü uyarmak için uzun dalga boyunun yarısı kadar dalga boyuna sahip bir foton kullanmakla aynıdır. İki fotonlu uyarma, yüksek foton yoğunluğu gerektirir ve hücrelere zarar vermemek için iki fotonlu mikroskopi, yüksek enerjili mod kilitli darbeli lazerler kullanır. Bu lazer, yalnızca 100 femtosaniye darbe genişliği ve 80 ila 100 MHz frekans ile yüksek tepe enerjisi ve düşük ortalama enerji ile lazer ışığı yayar. Darbeli lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal açıklıklı bir objektif lens kullanıldığında, objektif merceğin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki fotonlu uyarım yalnızca objektif merceğin odak noktasında meydana gelir. bu nedenle iki foton mikroskobu, Floresan algılama verimliliğini artıran konfokal bir iğne deliğine ihtiyaç duymaz.
Genel floresan fenomeninde, uyarma ışığının düşük foton yoğunluğu nedeniyle, bir floresan molekülü aynı anda yalnızca bir fotonu emebilir ve ardından tek fotonlu floresan olarak adlandırılan radyasyon geçişi yoluyla bir floresan foton yayabilir. Işık kaynağı olarak lazer ile floresan uyarma işlemi için, iki fotonlu ve hatta çoklu fotonlu floresan fenomeni meydana gelebilir. Şu anda, kullanılan uyarma ışık kaynağının yoğunluğu yüksektir ve foton yoğunluğu, flüoresan molekülün aynı anda iki fotonu emmesi gereksinimini karşılar. Uyarma ışık kaynağı olarak genel bir lazer kullanma sürecinde, foton yoğunluğu hala iki foton absorpsiyonu üretmek için yeterli değildir. Genellikle bir femtosaniye darbeli lazer kullanılır ve anlık gücü megavat mertebesine ulaşabilir. Bu nedenle, iki fotonlu flüoresansın dalga boyu, yarı uyarmalı dalga boyu uyarımı tarafından üretilen etkiye eşdeğer olan uyarma ışığının dalga boyundan daha kısadır.
İki fotonlu floresan mikroskobunun birçok avantajı vardır:
1) Uzun dalga boylu ışık, saçılmadan kısa dalga boylu ışığa göre daha az etkilenir ve numuneye kolayca nüfuz edebilir;
2) Odak düzlemi dışındaki flüoresan moleküller uyarılmaz, böylece daha fazla uyarma ışığı odak düzlemine ulaşabilir, böylece uyarma ışığı daha derin numunelere nüfuz edebilir;
3) Uzun dalga boylu yakın kızılötesi ışık, hücreler için kısa dalga boylu ışığa göre daha az toksiktir;
4) Örnekleri iki fotonlu mikroskopi ile görüntülerken, ışıkla ağartma ve fototoksisite yalnızca odak düzleminde mevcuttur. Bu nedenle, iki fotonlu mikroskopi, canlı hücreleri görüntülemek veya sabit noktalı ışıkla ağartma deneyleri yapmak için tek fotonlu mikroskopiden daha kalın numuneleri görüntülemek için daha uygundur.
Konfokal floresan mikroskopi bilgisi
Konfokal floresan mikroskobunun temel prensibi: numuneyi aydınlatmak için bir noktasal ışık kaynağı kullanarak, odak düzleminde iyi tanımlanmış bir çerçeveye sahip küçük bir ışık noktası oluşturulur. ışın ayırıcıdan oluşur. Işın ayırıcı, floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Işık kaynağının ve dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne deliği ve algılama iğne deliği olarak adlandırılan bir iğne deliği vardır. İkisinin geometrik boyutları aynıdır, yaklaşık 100-200 nm; odak düzlemindeki ışık noktasına göre, ikisi eşleniktir, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve son olarak aynı anda aydınlatma iğne deliğine ve algılama iğne deliğine odaklanabilir. Bu şekilde, odak düzleminden gelen ışık, tespit deliği menzili içinde konsantre edilebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından saçılan ışık, tespit deliğinin dışında engellenir ve görüntülenemez. Numune, lazerle nokta nokta taranır ve iğne deliğini tespit ettikten sonra fotoçoğaltıcı tüp, aynı zamanda, dijital bir sinyale dönüştürülen ve bilgisayara iletilen ve son olarak toplanan, nokta nokta karşılık gelen ışık noktasının konfokal görüntüsünü elde eder. ekranı tüm odak düzleminin net bir konfokal görüntüsüne dönüştürün. .
Her bir odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir ve bu optik kesit her zaman belirli bir kalınlığa sahiptir ve optik dilim olarak da bilinir. Odak noktasındaki ışık yoğunluğu odak olmayan noktadakinden çok daha fazla olduğundan ve odak dışı düzlem ışığı iğne deliği tarafından filtrelendiğinden, konfokal sistemin alan derinliği yaklaşık olarak sıfırdır ve boyunca tarama Z ekseni, numunenin odaklanmış noktasında iki boyutlu bir optik bölüm gözlemleyerek optik tomografiyi gerçekleştirebilir. XY düzlemi (odak düzlemi) taraması ile Z ekseni (optik eksen) taraması birleştirilerek, ardışık katmanların iki boyutlu görüntüleri biriktirilerek ve özel bilgisayar yazılımları ile işlenerek numunenin üç boyutlu görüntüsü elde edilebilir.
Yani, algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliği her zaman aynı noktaya odaklanır, böylece odaklama düzleminin dışında uyarılan flüoresan tespit iğne deliğine giremez.
Konfokal lazerin çalışma prensibinin basit ifadesi, ışık kaynağı olarak bir lazer kullanması ve geleneksel floresan mikroskop görüntüleme temelinde, bir lazer tarama cihazı ve bir eşlenik odaklama cihazının eklenmesi ve dijital görüntü elde edilmesi ve işlenmesidir. sistem bir bilgisayar tarafından kontrol edilir.
