Floresan Mikroskoplar ve Geleneksel Optik Mikroskopların Karşılaştırılması ve Özellikleri
Bir floresan mikroskobu sıradan bir optik mikroskoptan farklıdır. Numuneleri geleneksel bir ışık kaynağından gelen aydınlatma altında gözlemlemek yerine, numune içindeki flüoresan maddeleri uyarmak ve bunların flüoresans yaymasına neden olmak için belirli bir dalga boyundaki ışığı (genellikle ultraviyole veya mavi-mor ışık) kullanır. Bu nedenle, bir floresan mikroskobunun ışık kaynağı doğrudan aydınlatmaya hizmet etmez; numunedeki endojen floresan maddeleri uyarmak için bir enerji kaynağı görevi görür. Numuneyi kaynaktan gelen ışık nedeniyle değil, numunedeki floresan maddelerin uyarı ışığını emdikten sonra yaydığı floresans nedeniyle gözlemleyebiliyoruz.
Bir floresans mikroskobunun temel özelliğinin, test örneğindeki floresan maddeler için yeterli uyarım yoğunluğunu sağlamak üzere belirli bir dalga boyu aralığında bol miktarda uyarım ışığı sağlayabilen ışık kaynağı olduğu anlaşılmaktadır. Bu arada, bir floresan mikroskobunun ilgili bir filtre sistemi ile donatılması gerekir. Floresan histokimyası için temel bir araç olarak, temel olarak ultra yüksek basınçlı bir ışık kaynağından, bir filtre setinden (uyarma filtreleri ve bariyer filtreleri dahil), bir optik sistemden ve bir fotoğraf sisteminden oluşur. Floresan üretmek için örnekleri belirli bir dalga boyundaki ışıkla heyecanlandırarak çalışır.
Floresan uyarım yöntemleri: Dalga boyu aralığına göre UV uyarımı (ultraviyole aydınlatma yöntemi) ve BV uyarımı (mavi-mor ışık yöntemi) olarak sınıflandırılır. UV uyarımı, uyarım için 400 nm'den daha kısa ultraviyole yakın ışık kullanır. Görünür bir uyarma ışığı söz konusu değildir, bu nedenle gözlemlenen floresans, boyanın doğal floresansını gösterir. Bu, numune üzerindeki spesifik floresansın arka plan dokusunun otofloresansından ayırt edilmesini kolaylaştırır.
BV uyarma yöntemi: Uyarım, 404 nm ve 434 nm'de merkezlenen, ultraviyoleden mavi ışığa kadar değişen ışıkla gerçekleştirilir. Bu yöntemde mavi ışık numuneyi ışınladığından, floresans gözlem sisteminin kesme filtresinin, gerekli yeşil ve sarı floresansı tamamen iletirken mavi ışığı tamamen engellemesi gerekir. Bu yöntem, floresan antikor tekniklerinde kullanılan florokromlara uygulanır. Uyarma ışığının maksimum absorpsiyon dalga boyu ve floresansın maksimum emisyon dalga boyu nispeten yakındır, bu nedenle BV uyarımı için keskin kesim filtreleri gereklidir. Burada uyarma ışığı olarak mavi ışık kullanılıyor, bu da florokromların yüksek soğurma verimliliğini sağlıyor ve daha parlak görüntüler sağlıyor. Dezavantajı ise 500 nm'nin altındaki floresansın tespit edilememesi ve 500 nm'nin üzerindeki sinyallerin tüm görüntüye sarı bir renk vermesidir. Floresan antikor analizlerinde özgüllük çoğunlukla florokromun karakteristik rengine göre değerlendirilir. Bu nedenle, ince özgüllüğü değerlendirirken BV uyarma yönteminin yukarıdaki dezavantajı önemli bir etkiye sahip olabilir.
