İki fotonlu floresans mikroskobunun birçok avantajı vardır
1) Uzun dalga boylu ışık, kısa dalga boylu ışığa göre saçılmadan daha az etkilenir ve numuneye kolaylıkla nüfuz edebilir;
2) Odak düzleminin dışındaki floresan moleküller uyarılmaz, bu da odak düzlemine daha fazla uyarılma ışığının ulaşmasını sağlar ve uyarma ışığının daha derin numunelere nüfuz etmesine olanak tanır;
3) Uzun dalga boylu yakın kızılötesi ışık, hücreler için kısa dalga boylu ışığa göre daha az toksiktir;
4) Örnekleri iki fotonlu bir mikroskop kullanarak incelerken, ışıkla ağartma ve fototoksisite yalnızca odak düzleminde meydana gelir. Bu nedenle, iki fotonlu mikroskoplar, kalın örneklerin gözlemlenmesi, canlı hücrelerin gözlemlenmesi veya sabit noktalı ışıkla ağartma deneylerinin gerçekleştirilmesi için tek fotonlu mikroskoplardan daha uygundur.
Konfokal floresan mikroskobu hakkında bilgi
Eş odaklı floresan mikroskobunun temel prensibi: Odak düzleminde küçük, iyi tanımlanmış bir ışık noktası oluşturacak şekilde numuneyi aydınlatmak için bir nokta ışık kaynağı kullanın. Aydınlatıldıktan sonra noktanın yaydığı floresans, objektif mercek tarafından toplanır ve orijinal aydınlatma ışık yolu boyunca dikroik aynaya geri gönderilir. bir ışın ayırıcı oluşturur. Spektrometre floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Işık kaynağının ve dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne deliği ve algılama iğne deliği olarak adlandırılan bir iğne deliği bulunmaktadır. İkisinin geometrik boyutları tutarlıdır; yaklaşık 100-200nm; Odak düzlemindeki ışık noktasına göre ikisi eşleniktir, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve sonuçta aynı anda aydınlatma iğne deliğine ve algılama iğne deliğine odaklanabilir. Bu şekilde odak düzleminden gelen ışık, algılama deliği içinde yoğunlaştırılabilirken, odak düzleminin üstünden veya altından saçılan ışık, algılama deliğinin dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Numune lazerle noktadan noktaya taranır ve tespit iğne deliğinin arkasındaki fotomultiplier tüpü aynı zamanda karşılık gelen ışık noktasının eş odaklı görüntüsünü elde eder, bu görüntü dijital bir sinyale dönüştürülür ve bilgisayara iletilir ve sonunda toplanır. ekranda tüm odak düzleminin net bir eş odaklı görüntüsüne dönüştürülür. .
Her odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir. Bu optik kesit her zaman belirli bir kalınlığa sahiptir ve aynı zamanda optik ince kesit olarak da adlandırılır. Odaktaki ışık yoğunluğu, odak dışı alandaki ışık yoğunluğundan çok daha büyük olduğundan ve odak dışı düzlemdeki ışık iğne deliği tarafından filtrelendiğinden, eş odaklı sistemin alan derinliği yaklaşık olarak sıfırdır. Z ekseni yönü boyunca tarama, optik tomografiyi gerçekleştirebilir ve istenen numuneyi oluşturabilir. Numunenin odaklanmış noktasında iki boyutlu optik bölümü gözlemleyin. XY düzlemi (odak düzlemi) taramasını Z ekseni (optik eksen) taramasıyla birleştirerek, iki boyutlu görüntülerin sürekli seviyelerini biriktirerek ve bunları özel bilgisayar yazılımıyla işleyerek, numunenin üç boyutlu bir görüntüsü elde edilebilir.
Yani, algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliği her zaman aynı noktaya odaklanır, böylece odak düzleminin dışında uyarılan floresan, algılama iğne deliğine giremez.
Lazer konfokalin çalışma prensibinin basit ifadesi, ışık kaynağı olarak lazeri kullanmasıdır. Geleneksel floresans mikroskobu görüntülemesine, bir lazer tarama cihazı ve bir konjuge odaklama cihazı eklenir ve sistem, dijital görüntüleri toplamak ve işlemek için bir bilgisayar tarafından kontrol edilir.
