Optik mikroskobun ana gözlem yöntemi floresan gözlemidir.
Floresan, bir floresan maddenin belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlandığında neredeyse aynı anda daha uzun dalga boyuna sahip ışık yaydığı süreci ifade eder (Şekil 1). Belirli bir dalga boyundaki (uyarma dalga boyu) ışık, florofordakiler gibi bir moleküle çarptığında, foton enerjisi molekülün elektronları tarafından emilir. Daha sonra, elektronlar taban durumundan (S0) daha yüksek bir enerji düzeyine, uyarılmış duruma (S1') geçer. Bu sürece uyarma① denir. Elektron, 10-9–10-8 saniye boyunca uyarılmış durumda kalır ve bu sırada elektron bir miktar enerji kaybeder②. Elektronların uyarılmış durumdan (S1) çıkıp temel duruma③ geri dönme işlemi sırasında, uyarma işlemi sırasında emilen kalan enerji serbest bırakılır.
Floresan molekülün uyarılmış durumda kalma süresi, genellikle nanosaniye düzeyinde olan ve floresan molekülün kendisinin doğal bir özelliği olan floresans ömrüdür. Floresan ömür boyu görüntüleme teknolojisini kullanan Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (FLIM), ömür boyu floresan görüntüleme (FLIM) olarak adlandırılır. Floresans yoğunluğu görüntülemeye ek olarak, moleküler konformasyonu, moleküller arası etkileşimleri ve moleküllerin mikro ortamını elde etmek için daha derinlemesine işlevsel ve doğru ölçümler elde edilebilir. Geleneksel optik görüntüleme ile elde edilmesi zor olan bilgiler.
Floresansın diğer bir önemli özelliği, uyarma ve emisyon tepe noktaları arasındaki dalga boyundaki fark olan Stokes kaymasıdır (Şekil 2). Tipik olarak emisyon dalga boyu uyarma dalga boyundan daha uzundur. Bunun nedeni, elektronların, floresan madde uyarıldıktan sonra ve fotonları serbest bırakmadan önce gevşeme süreci yoluyla enerjilerinin bir kısmını kaybedecek olmalarıdır. Daha büyük Stokes kaymasına sahip floresan maddeleri, bir floresan mikroskobu altında gözlemlemek daha kolaydır.
Floresan Mikroskopisi ve Floresan Filtre Küpleri
Floresan mikroskobu, floresan özelliklerini gözlem ve görüntüleme için kullanan ve hücre biyolojisi, nörobiyoloji, botanik, mikrobiyoloji, patoloji ve genetik gibi çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılan bir optik mikroskoptur. Floresan görüntüleme, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük avantajlarına sahiptir ve belirli proteinlerin ve organellerin doku ve hücrelerdeki dağılımının gözlemlenmesi, kolokalizasyon ve etkileşim çalışması, iyon konsantrasyonu değişiklikleri gibi yaşam dinamik süreçlerinin izlenmesi için çok uygundur. , vesaire.
Hücrelerdeki moleküllerin çoğu flüoresan yaymaz ve onları görebilmek için flüoresan olarak işaretlenmiş olmaları gerekir. Doğrudan etiketleme (DNA'yı etiketlemek için DAPI kullanmak gibi) veya antikorların antijen bağlama özelliklerini kullanarak immün boyama veya hedef proteinleri etiketlemek için floresan proteinleri (GFP, yeşil floresan proteini gibi) kullanma gibi birçok floresan etiketleme yöntemi vardır. ve tersine çevrilebilir bağlama. Sentetik boyalar (Fura-2 gibi) vb.
Şu anda floresan mikroskobu, çeşitli laboratuvarların ve görüntüleme platformlarının standart görüntüleme ekipmanı haline geldi ve günlük deneylerimiz için iyi bir yardımcı. Floresan mikroskoplar temel olarak üç kategoriye ayrılır: dikey floresan mikroskoplar (dilimleme için uygundur), ters floresan mikroskoplar (dilimleme dikkate alınarak canlı hücreler için uygundur), floresan stereoskoplar (bitkiler, zebra balığı (yetişkin/embriyo) gibi daha büyük örnekler için uygundur) ), medaka, fare/sıçan organları vb.).
Floresan filtre bloğu, mikroskop floresan görüntülemenin temel bileşenidir. Üç bölümden oluşur: uyarma filtresi, emisyon filtresi ve dikroik ışın ayırıcı. Filtre tekerleğine takılır. Örneğin, Leica DMi8, bir 6-konum filtre tekerleği ile donatılmıştır (Şek. 3 ). Farklı mikroskop tekerleklerinin konumlarının sayısı farklı olacaktır ve bazı mikroskoplar filtre bloğu slaytları kullanır.
Filtre bloğu, floresan görüntülemede önemli bir rol oynar: uyarma filtresi, örneği uyarmak için uyarma ışığını seçer ve diğer dalga boylarındaki ışığı bloke eder; Uyarma filtresinden geçen ışık, dikroik aynadan geçer (işlevi, uyarma ışığını yansıtmak ve flüoresanı iletmektir), Yansımadan sonra, objektif mercek tarafından odaklanır, numuneyi ışınlar ve karşılık gelen flüoresanı uyarır, yani , yayılan ışık. Yayılan ışık objektif lens tarafından toplanır, dikroik ışın ayırıcıdan geçer ve emisyon filtresine ulaşır. Şekil 4'te gösterildiği gibi: uyarma dalga boyu 450-490nm'dir, dikroik ayna 510nm'den kısa ışığı yansıtır, 510nm'den uzun ışığı iletir ve yayılan ışığın alım aralığı 520-560nm'dir.
