Optik mikroskobun ana gözlem yöntemi floresan gözlemidir.
Floresan fenomeni
Floresan, bir floresan maddenin belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlandığında neredeyse aynı anda daha uzun dalga boyuna sahip ışık yaydığı süreci ifade eder (Şekil 1). Belirli bir dalga boyundaki (uyarma dalga boyu) ışık bir moleküle (florofordaki bir molekül gibi) çarptığında, foton enerjisi molekülün elektronları tarafından emilir. Daha sonra, elektronlar taban durumundan (S0) daha yüksek bir enerji düzeyine, uyarılmış duruma (S1') geçer. Bu sürece uyarma① denir. Elektron, 10-9–10-8 saniye boyunca uyarılmış durumda kalır ve bu sırada elektron bir miktar enerji ② kaybeder. Uyarılmış durumdan (S1) ayrılma ve temel duruma ③ geri dönme sürecinde, uyarma işlemi sırasında emilen kalan enerji serbest bırakılacaktır.
Bir flüoresan molekülün uyarılmış durumda kalma süresi, flüoresan molekülün kendisinin doğal bir özelliği olan genellikle nanosaniye cinsinden flüoresan ömrüdür. Floresan ömrü kullanan görüntüleme teknolojisi, moleküler konformasyon, moleküller arası etkileşimler ve moleküler mikro ortamlar elde etmek için floresan yoğunluğu görüntülemeye ek olarak daha derinlemesine fonksiyonel ve doğru ölçümler yapabilen Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (FLIM) olarak adlandırılır. geleneksel optik görüntüleme ile elde edilmesi zor olan bilgiler.
Floresansın diğer bir önemli özelliği, uyarma ve emisyon tepe noktaları arasındaki dalga boyundaki fark olan Stokes kaymasıdır (Şekil 2). Genellikle emisyon ışık dalga boyu, uyarma ışık dalga boyundan daha uzundur. Bunun nedeni, flüoresan madde uyarıldıktan sonra ve foton serbest bırakılmadan önce, elektronların gevşeme süreci yoluyla enerjilerinin bir kısmını kaybedecek olmalarıdır. Daha büyük Stokes kaymasına sahip floresan maddeleri, bir floresan mikroskobu altında gözlemlemek daha kolaydır.
Floresan Mikroskopları ve Floresan Filtre Blokları
Floresan mikroskobu, gözlemlemek ve görüntülemek için floresan özelliklerini kullanan ve hücre biyolojisi, nörobiyoloji, botanik, mikrobiyoloji, patoloji, genetik ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılan bir optik mikroskoptur. Floresan görüntüleme, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük avantajlarına sahiptir ve belirli proteinlerin, organellerin vb. doku ve hücrelerdeki dağılımının gözlemlenmesi, ortak lokalizasyon ve etkileşim çalışması ve yaşam dinamiğinin izlenmesi için çok uygundur. iyon konsantrasyonundaki değişiklikler gibi süreçler.
Hücrelerdeki moleküllerin çoğu flüoresan yaymaz ve onları görebilmek için flüoresan olarak işaretlenmiş olmaları gerekir. Doğrudan etiketlenebilen (DNA'yı etiketlemek için DAPI kullanmak gibi) veya antikorların antijen bağlama özelliklerini kullanarak immün boyama veya hedef protein floresan proteinlerle (GFP, yeşil gibi) etiketlenebilen birçok floresan etiketleme yöntemi vardır. floresan protein) veya tersinir bağlanma. sentetik boyalar (Fura-2 gibi), vb.
Şu anda floresan mikroskobu, çeşitli laboratuvarların ve görüntüleme platformlarının standart görüntüleme ekipmanı haline geldi ve günlük deneylerimiz için iyi bir yardımcı. Floresan mikroskoplar temel olarak üç kategoriye ayrılır: dikey floresan mikroskoplar (kesitlemeye uygun), ters floresan mikroskoplar (kesitler dikkate alındığında canlı hücreler için uygundur), floresan stereoskopik mikroskoplar (bitkiler, zebra balığı (yetişkin/yetişkin) gibi daha büyük örnekler için uygundur) embriyo), medaka, fare/sıçan organları vb.).
Floresan filtre bloğu, mikroskoplarda floresan görüntülemenin temel bileşenidir. Bir uyarma filtresi, bir emisyon filtresi ve bir dikroik ışın ayırıcıdan oluşur. Bir 6-pozisyon filtre çarkı (Şekil 3) ile donatılmış Leica DMi8 gibi filtre çarkına takılır. ). Farklı mikroskopların farklı tekerlek konumları vardır ve bazı mikroskoplar filtre slaytları kullanır.
Filtre bloğu, floresan görüntülemede önemli bir rol oynar: uyarma filtresi, örneği uyarmak için uyarma ışığını seçer ve ışığın diğer dalga boylarını bloke eder; Uyarma filtresinden geçen ışık, bir dikroik ışın ayırıcıdan geçer (rolü, uyarma ışığını yansıtmak ve flüoresanı iletmektir), Yansımadan sonra, objektif mercek tarafından odaklanır, numuneye ışınlanır ve karşılık gelen flüoresan uyarılır. ışık yaymak. Yayılan ışık objektif lens tarafından toplanır, dikroik ışın ayırıcıdan geçer ve emisyon filtresine ulaşır. Şekil 4'te gösterildiği gibi: uyarma dalga boyu 450-490nm'dir, dikroik ışın ayırıcı 510nm'den kısa ışığı yansıtır, 510nm'den uzun ışığı iletir ve emisyon ışığı alma aralığı 520-560nm'dir.
Floresan mikroskoplarında yaygın olarak kullanılan floresan filtreler iki türe ayrılabilir: uzun geçiş (kısa için LP) ve bant geçiren (kısa için BP). Bant geçişi genellikle merkezi dalga boyu ve aralığın genişliği tarafından belirlenir, örneğin 480/40, yani 460-500nm'den gelen ışık geçilebilir. 515 LP gibi uzun geçiş filtreleri, 515 nm'den daha uzun dalga boylarına sahip ışığı geçirir (Şekil 5).
Floresan maddelerin karakteristik uyarma (absorpsiyon) eğrisi ve emisyon eğrisi vardır, uyarma zirvesi ideal uyarma dalga boyudur (uyarma ışık enerjisini azaltabilen, hücreleri ve boyaları koruyabilen yüksek uyarma verimliliği) ve emisyon eğrisi emisyon floresan dalga boyudur Aralık. Bu nedenle, deneyde, uyarma için mümkün olduğunca uyarma zirvesine yakın dalga boyunu seçeceğiz ve alıcı aralığın emisyon tepe noktasını içermesi gerekiyor. Örneğin, Alexa Fluor 488'in uyarma zirvesi 500nm'dir ve floresan mikroskobunda 480/40'lık uyarma filtresi seçilebilir.
Filtre küplerinin detayları mikroskop görüntüleme yazılımında görüntülenebilir. Boyaları anlamak ve örneğinizle en iyi eşleşen filtreyi bulmak, floresan görüntüleme için çok önemlidir. Floresan boyaların ve floresan proteinlerin spektral bilgileri genellikle talimatlarda belirtilir ve ayrıca çevrimiçi olarak da bulunabilir.
Floresan probların uyarım ve emisyon dalga boylarına ek olarak, filtre bloklarının seçiminde spesifik olmayan uyarım olup olmadığı ve çok renkli etiketli numuneler için çapraz renk olup olmadığı da dikkate alınmalıdır. Ayrıca kullanılan floresan ışık kaynağına da dikkat etmek gerekir. Günümüzde yaygın olarak kullanılan floresan ışık kaynakları arasında son yıllarda hızla gelişen cıvalı lambalar, metal halide lambalar ve LED ışık kaynakları bulunmaktadır. Bir flüoresan ışık kaynağının spektrumu sürekli veya süreksizdir ve enerji, farklı dalga boyu bantlarında farklı olacaktır. LED ışık kaynağı, nispeten dar spektral bandı, daha kararlı enerji çıkışı, uzun ömrü, daha güvenli ve çevre koruma ve diğer birçok avantajı nedeniyle giderek floresan mikroskobunun ana ışık kaynağı haline geliyor.
Mikroskobun yerleşik filtre bloğuna ek olarak, harici bir hızlı tekerlek de vardır (Şekil 7). Leica'nın harici hızlı çarkına bitişik filtrenin dönüştürme hızı 27 ms'dir ve bu, FRET ve Fura2 oranlı kalsiyum görüntüleme gibi yüksek hızlı çok renkli deneyleri gerçekleştirebilir. (Şekil 8) ve ark.
Çok çeşitli floresan mikroskopi görüntüleme teknikleri
Farklı floresan görüntüleme ihtiyaçlarını karşılamak için, floresan mikroskoplarına ek olarak, çeşitli floresan mikroskopi görüntüleme çözümleri geliştirilmiştir:
Leica THUNDER Imager gibi geniş alanlı yüksek tanımlı görüntüleme sistemleri, görüntüleme sırasında odak dışı düzlem girişim sinyallerini verimli bir şekilde ortadan kaldırmak, net görüntüler ve yüksek hızlı görüntülemenin avantajlarını sunmak için Leica'nın yenilikçi Clearing teknolojisini kullanır;
Konfokal lazer tarama mikroskobu, odak dışı düzlem girişimini ortadan kaldırmak için iğne delikleri kullanır, optik kesitleri gerçekleştirir ve yüksek tanımlı görüntüler ve üç boyutlu görüntüler elde eder;
Kırınım sınırını aşan ultra yüksek çözünürlüklü mikroskoplar ve nano mikroskoplar, 200 nm'den küçük ince yapıları gözlemleyebilir;
Kalın doku ve derinin in vivo olarak görüntülenmesi için çoklu foton uyarma ilkesini kullanan bir çoklu foton görüntüleme sistemi;
Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe, hızlı görüntüleme hızına, yüksek çözünürlüğe, düşük fototoksisiteye sahip, özellikle geliştirme araştırmaları ve in vivo dinamik gözlem için uygun olan hafif levha görüntüleme teknolojisi;
Floresan madde konsantrasyonu, foto ağartma, eksitasyon ışık yoğunluğu vb. faktörlerden etkilenmeyen Floresans ömür boyu görüntüleme (FLIM), daha derinlemesine işlevsel ve doğru ölçümler yapabilir;
Floresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) ve Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi (FCCS), floresan moleküllerin moleküler sayısını ve difüzyon katsayısını ölçer, böylece moleküler konsantrasyonu, moleküler boyutu, viskoziteyi, moleküler hareketi, moleküler bağlanma/ayrışmayı ve moleküler optik özellikleri analiz eder;
Son derece yüksek z ekseni çözünürlüğüne sahip Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRF), hücre zarı yüzeylerinin moleküler yapısını ve dinamiklerini incelemek için idealdir.
