Boyama teknikleri ve mikroorganizmaların mikroskobik gözlemi
1. Amaç
1.1 Mikrobiyal smear ve boyamanın temel tekniklerini öğrenir.
1.2 Bakterilerin basit boyama yönteminde ustalaşın.
1.3 Bakterilerin morfolojik özelliklerini ön olarak anlamak ve yağlı lenslerin ve aseptik operasyon tekniklerinin nasıl kullanılacağına ilişkin bilgileri pekiştirmek.
2 İlke
Bakterilerin bulaşması ve boyanması mikrobiyoloji deneylerinde temel bir tekniktir. Bakteri hücreleri küçük ve şeffaftır, bu da onları sıradan bir ışık mikroskobu altında tanımlamayı zorlaştırır; lekelenmiş olmalılar. Bakterileri boyamak için tek bir boya kullanılır, böylece lekelenen bakteriler arka plandan net bir renk farkı oluşturur, böylece morfolojileri ve yapıları daha net gözlemlenebilir. Bu yöntemin kullanımı kolaydır ve bakteri hücrelerinin genel şeklini ve bakterilerin dizilişini gözlemlemek için uygundur. Temel boyalar genellikle basit boyama için kullanılır. Bunun nedeni, nötr, alkali veya zayıf asidik çözeltilerde bakteri hücrelerinin genellikle negatif yüklü olması ve bazik boyalar iyonize edildiğinde moleküllerinin boyayıcı kısmının pozitif yüklü olması, dolayısıyla alkali olmalarıdır. Boyanın lekeleyici kısmı kolaylıkla bakterilerle birleşerek onları renklendirir. Lekeli bakteri hücreleri arka planla keskin bir kontrast oluşturarak mikroskop altında tespit edilmelerini kolaylaştırır. Basit boyama için yaygın olarak kullanılan boyalar arasında metilen mavisi, kristal mor, bazik fuksin vb. yer alır. Bakteriler şekerleri ayrıştırıp asit ürettiğinde, kültür ortamının pH'ının düşmesine neden olduğunda bakteriler üzerindeki pozitif yük artar. Şu anda boyama için eozin, asit fuksin veya Kongo kırmızısı gibi asidik boyalar kullanılabilir. Boyamadan önce bakterilerin sabitlenmesi gerekir. İki amacı vardır: Biri bakterileri öldürüp cam slayta yapışmalarını sağlamaktır; diğeri ise boyalara olan ilgilerini arttırmaktır. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem ısıtma ve kimyasal sabitlemedir. Sabitlerken hücrelerin orijinal şeklini korumaya çalışın.
3 malzeme
3.1 Bakteriler: Bacillus subtilis 12-18h besin agar eğik kültürü, Staphylococcus aureus 24 saat besin agar eğik kültürü, Escherichia coli 24 saat besin agar eğik kültürü, fırıncı mayası agar eğik kültürü.
3.2 Boyama maddesi: Lu'nun alkalin metilen mavisi boyası (veya amonyum oksalat kristal menekşe boyası), karbolik asit fuksin boyası.
3.3 Aletler veya diğer aletler: mikroskop, alkol lambası, slayt, aşılama halkası, slayt rafı, çift katmanlı şişe (sedir yağı ve ksilen içeren), lens dokusu, fizyolojik tuzlu su veya damıtılmış su vb.
4. İşlem: smear → kurutma → sabitleme → boyama → yıkama → kurutma → mikroskobik inceleme.
5 adım
5.1 Bulaşma: İki adet temiz ve yağsız cam slayt alın. Steril koşullar altında, cam slaytın her merkezine küçük bir damla normal salin (veya damıtılmış su) koyun. Bakterileri Bacillus subtilis'ten sterilize etmek için bir aşılama döngüsü kullanın. , Micrococcus luteus ve Escherichia coli, eğimli su damlacıklarından bir miktar bakteriyel çim toplayın, iyice karıştırın ve ince bir film halinde uygulayın. Bakteriyel süspansiyon (veya sıvı kültür) smear kullanıyorsanız, 2 ila 3 öze seçmek ve bunları doğrudan slayt üzerine uygulamak için bir aşılama özesi kullanabilirsiniz. Çok fazla fizyolojik salin (distile su) damlatmamaya ve bakterileri uzaklaştırmamaya dikkat edin ve eşit ve çok kalın olmayan bir şekilde uygulayın.
5.2 Kurutma Oda sıcaklığında doğal olarak kurutun. Ayrıca, kaplamalı tarafı yukarı bakacak şekilde alkol lambasının üzerinde hafifçe ısıtarak kurutabilirsiniz. Ancak aleve çok fazla yaklaşmamaya dikkat edin çünkü çok yüksek sıcaklık bakterilerin morfolojisini yok eder.
5.3 Sabitleme Isıtmalı kurutma kullanılıyorsa, sabitleme ve kurutma tek adımda birleştirilir ve yöntem kurutmayla aynıdır. Sürün, kurulayın ve ısıyla sabitleyin.
5.4 Boyama: Slaytı slayt rafına düz bir şekilde yerleştirin ve smear üzerine 1 ila 2 damla boya solüsyonu ekleyin (boya solüsyonunun sadece smear filmini kaplaması uygundur). Lu'nun bazik metilen mavisi ile 1 ila 2 dakika boyunca lekeleyin ve yaklaşık 1 dakika boyunca karbolik asit fuksin (veya amonyum oksalat kristal menekşe) ile lekeleyin.
5.5 Suyla yıkama: Boya solüsyonunu dökün ve smearden akan su renksiz hale gelinceye kadar slaydın bir ucundan musluk suyuyla hafifçe durulayın. Su ile yıkama yaparken kaplanmış yüzeyi doğrudan su ile yıkamayınız. Smear filminin düşmesini önlemek için su akışı çok hızlı veya çok büyük olmamalıdır.
5.6 Kurutma: Slayt üzerindeki su damlacıklarını silkeleyin ve doğal olarak kurutun, saç kurutma makinesiyle kurutun veya emici kağıtla emdirin (bakterileri silmemeye dikkat edin). 5.7 Mikroskobik inceleme Smear kuruduktan sonra mikroskobik inceleme yapın. Yağlı mercekle incelemeden önce lekenin tamamen kuru olması gerekir.
6 Sonuçlar Tek boyama sonrasında gözlenen E. coli ve Micrococcus luteus'un morfolojisini çizin.
