Floresan Mikroskobu Prensipleri
Floresan mikroskoplar, sıradan optik mikroskoplardan farklıdır. Örnekleri sıradan ışık kaynaklarının aydınlatması altında gözlemlemek yerine, belirli bir dalga boyundaki ışığı (genellikle ultraviyole ışık, mavi-mor ışık) kullanarak örneklerdeki floresan maddeleri mikroskop altında uyararak floresan yaymalarını sağlarlar. Bu nedenle, bir floresan mikroskobunun ışık kaynağı doğrudan aydınlatma işlevi görmez, numune içindeki floresan maddeleri uyaran bir enerji kaynağı olarak işlev görür. Numuneyi gözlemleyebilmemizin nedeni, ışık kaynağının aydınlatmasıdır, ancak numunedeki flüoresan madde uyarılmış ışık enerjisini soğurduktan sonra sunulan flüoresan olayıdır.
Floresan mikroskobunun özelliğinin, ışık kaynağının belirli bir dalga boyu aralığında büyük miktarda uyarma ışığı sağlayabilmesi olduğu görülebilir, böylece test edilen numunedeki floresan madde gerekli yoğunlukta uyarma ışığı elde edebilir. Aynı zamanda, floresan mikroskobu ilgili filtre sistemine sahip olmalıdır.
Floresan mikroskopi, immünofloresan histokimyasında önemli bir araçtır. Ultra yüksek voltajlı ışık kaynağı, filtre sistemi (uyarma ve bastırma filtre plakası dahil), optik sistem ve fotoğraf sistemi ve diğer ana bileşenlerden oluşur. Numuneyi floresan yayması için uyarmak için belirli bir dalga boyundaki ışığı kullanır.
Floresanı uyarmanın yolu: Işığın dalga boyu aralığına göre iki türe ayrılabilir: UV uyarma yöntemi (ultraviyole aydınlatma yöntemi kullanılarak) ve BV uyarma yöntemi (mavi-mor ışık kullanılarak). UV uyarma yöntemi, uyarma için 400 nm'den daha kısa ultraviyole yakın ışık kullanır. Bu yöntemde görünür uyarma ışığı yoktur, bu nedenle gözlemlenen floresan boyanın doğal floresansını sunar ve numune üzerindeki spesifik floresanı arka plan dokusunun otofloresansından ayırt etmek kolaydır.
BV uyarma yöntemi, ultraviyoleden mavi ışığa uyarma için 404nm ve 434nm'ye dayanmaktadır. Bu yöntem, numuneyi ışınlamak için mavi ışık kullanır, bu nedenle floresan gözlem sisteminin kesme filtresi, mavi ışığı tamamen bloke edebilen ve gerekli yeşil ve sarı floresanı tamamen geçebilen bir filtre kullanmalıdır. Floresan antikor deneyleri için floresan boyalar. Uyarma ışığının maksimum absorpsiyon dalga boyu, flüoresanın maksimum emisyon dalga boyuna nispeten yakındır, bu nedenle BV uyarma yönteminde kullanılan filtre keskin bir kesme filtresi kullanmalıdır. Bu yöntem, uyarma ışığı olarak mavi ışığı kullanabilir, böylece flüoresan pigmentin absorpsiyon verimliliği daha yüksektir ve daha parlak bir görüntü elde edilebilir. Dezavantajı, 500nm'nin altındaki floresansın görülememesi ve 500nm'nin üzerindeki floresansın tüm görüntünün sarı görünmesine neden olmasıdır. Floresan antikor yönteminde, florokromun özgüllüğü genellikle florokromun benzersiz rengine göre değerlendirilir. Bu nedenle, ince özgüllük tartışılırken, BV uyarma yönteminin yukarıda belirtilen eksikliklerinin genellikle büyük bir etkisi vardır.
Özetlemek gerekirse, floresan mikroskobunun aydınlatması, kondansatörün yapısına ve uyarma ışığının dalga boyuna göre aşağıdaki üç noktaya göre düşünülebilir.
① Floresan görüntünün kontrast gereksinimleri açısından, aydınlatma için UV uyarımlı karanlık alan yoğunlaştırıcısı kullanılır.
② Görüntünün parlaklığı göz önüne alındığında, BV uyarma filtresi en yüksek karanlık alan gözlem verimliliğine sahiptir.
③UV uyarma filtresi karanlık alan gözlemi ve BV uyarma karanlık alan yoğunlaştırıcı aydınlatmasının özellikleri, bu iki aydınlatma yöntemi arasında kabul edilebilir, ancak ilki daha güçlü karanlık alan özelliklerine sahiptir ve daha parlak görüntüler gösterir. Kontrast küçüktür; ikincisi, karanlık alan ışık yolunun özelliklerini korur, böylece görüntülenen görüntü daha koyu olur ve kontrast iyileştirilir. Gerçekte bir floresan mikroskobu kullanıldığında, gözlem için numunenin gereksinimlerine en uygun aydınlatma yöntemi kullanılmalıdır.
En iyi kontrasta sahip UV uyarımlı karanlık alan kondansatörü aydınlatılsa bile, numune tarafından kırılan veya saçılan ultraviyole uyarma ışığının bir kısmının objektif merceğe gireceği belirtilmelidir. Otofloresans, görüntü yanıtını kötüleştirebilir. Bu nedenle, kesme filtresi olarak oküler önünde UV emici bir filtre kullanılmalıdır.
