Multiphoton mikroskopi görüntüleme: nöronları in vivo olarak görüntülemek için çeşitli teknikler
Geleneksel tek fotonlu geniş alan floresan mikroskobu ile karşılaştırıldığında, çok fotonlu mikroskopi (MPM), optik kesit alma ve derin görüntüleme işlevlerine sahiptir. 2019'da Jerome Lecoq ve diğerleri. ilgili MPM teknolojisini üç yönden tartıştı: beynin derinliklerinde nöron görüntüleme, büyük nöron görüntüleme ve yüksek hızlı nöron görüntüleme.
Nöron aktivitesini karmaşık davranışla ilişkilendirmek için, genellikle derin korteksteki nöronları görüntülemek gerekir, bu da MPM'nin derin görüntüleme yeteneğine sahip olmasını gerektirir. Uyarma ve emisyon ışığı, MPM'nin görüntüleme derinliğini sınırlayan ana faktör olan biyolojik doku tarafından yüksek oranda dağılacak ve emilecektir. Saçılma sorunu, lazer yoğunluğunun artırılmasıyla çözülebilse de, numunenin yanması, odaklanmanın bozulması ve yüzeye yakın Floresan uyarımı gibi başka sorunları da beraberinde getirecektir. MPM görüntülemenin derinliğini artırmanın en iyi yolu, uyarma ışığı olarak daha uzun dalga boylarını kullanmaktır.
Ek olarak, iki fotonlu (2P) görüntüleme için, odak dışı ve yüzeye yakın floresan uyarımı derinliği sınırlayan en büyük iki faktörken, üç fotonlu (3P) görüntüleme için bu iki sorun büyük ölçüde azalır, ancak flüoresan nedeniyle üç fotonlu görüntüleme Grubun soğurma kesiti 2P'ninkinden çok daha küçüktür, bu nedenle 2P tarafından uyarılanla aynı yoğunluktaki flüoresan sinyalini elde etmek için bir kat daha yüksek atım enerjisi gerekir. Fonksiyonel 3P mikroskopi, nöronal aktiviteyi zamanında örneklemek için daha hızlı tarama gerektiren yapısal 3P mikroskopiden daha zahmetlidir; her pikselin bekleme süresi içinde yeterli sinyalleri toplamak için daha yüksek darbe enerjisi gerekir.
Karmaşık davranışlar genellikle hem yerel hem de uzun menzilli bağlantıları olan büyük beyin ağlarını içerir. Nöron aktivitesini davranışla ilişkilendirmek için, çok büyük ve yaygın olarak dağılmış nöronların aktivitesini aynı anda izlemek gerekir. Beyindeki sinir ağı, gelen uyarıları onlarca milisaniye içinde işler. Bu hızlı sinir ağını anlamak için Nöron dinamiklerini incelemek için, MPM'nin nöronları hızlı bir şekilde görüntüleme yeteneğine sahip olması gerekir. Hızlı MPM yöntemleri, tek ışınlı tarama teknikleri ve çok ışınlı tarama teknikleri olarak ayrılabilir.
Tek ışınlı tarama teknolojisi, geniş bir görüş alanı (FOV) ile nöral dokuda yüksek hızda geçiş sağlar
Nöronları görüntülemek için MPM kullanıldığında, rastgele erişimli tarama (lazer ışını tüm görüş alanı üzerinde seçilen herhangi bir noktada hızlı bir şekilde taranır) yalnızca ilgili nöronları tarayabilir; ayrıca lazer ışınının tarama süresini de optimize eder. Rastgele erişimli tarama (Şekil 1), bir piezoelektrik dönüştürücüyü bir radyo frekansı sinyaliyle uygun bir kristale bağlayarak çalışan bir akustik-optik saptırıcı (AOD) ile elde edilebilir. Ortaya çıkan akustik dalgalar, periyodik bir kırılma indeksi ızgarasına neden olur. Kırınım, bir lazer ışını bir ızgaradan geçtiğinde meydana gelir. Ses dalgasının yoğunluğu ve frekansı, kırılan ışığın yoğunluğunu ve yönünü değiştirmek için radyo frekansı elektrik sinyali ile ayarlanabilir, böylece bir AOD kullanılarak tek boyutlu yatay keyfi nokta taraması gerçekleştirilebilir ve 3D gerçekleştirilebilir. diğer eksenel tarama teknolojileri rasgele erişimli tarama ile birleştirilmiş bir çift AOD kullanarak. Bununla birlikte, bu teknik numunenin hareketine karşı çok hassastır ve hareket artefaktlarına eğilimlidir. Şu anda, hızlı raster tarama, yani FOV'da aşamalı tarama yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü algoritma hareket kalıntılarını kolayca çözebilir.
Neokortikal L2/3 nöronlarının in vivo AOD tabanlı iki fotonlu görüntülemesi[2]
Hızlı 2B tarama için titreşimli bir ayna kullanarak, hızlı 3B tarama için titreşimli bir aynayı ve ayarlanabilir bir elektrikli merceği bir araya getirerek hızlı raster taramayı gerçekleştirmenin birçok yolu vardır, ancak ayarlanabilir elektrikli mercek, eksenel yönde hızlı bir şekilde odaklanamaz. görüntüleme hızını etkileyen mekanik atalet Anahtarlama, artık bir uzamsal ışık modülatörü (SLM) ile değiştirilebilir.
Uzaktan odaklama, Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3D görüntüleme elde etmenin bir yoludur. LSU modülünde, tarama galvanometresi yatay olarak tarar ve ASU modülü, L1 objektif lensini ve M aynasını içerir ve eksenel tarama, ayarlanarak gerçekleştirilir. M'nin konumu. Bu teknik, yalnızca ana objektif merceği L2 tarafından ortaya çıkan optik sapmayı düzeltmekle kalmaz, aynı zamanda hızlı eksenel taramayı da mümkün kılar. Daha fazla nöron görüntüsü elde etmek için, mikroskobun objektif lens tasarımı ayarlanarak FOV büyütülebilir, ancak büyük NA ve geniş FOV'ye sahip objektif lens genellikle ağırdır ve hızlı eksenel tarama için hızlı hareket edemez, bu nedenle büyük FOV sistemleri Telefokusa güvenir , SLM ve ayarlanabilir motorlu lensler.
Uzaktan odaklanan iki fotonlu görüntüleme sisteminin şematik diyagramı[3] Çok ışınlı tarama teknolojisi, nöronal dokunun farklı konumlarını aynı anda görüntüleyebilir
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm ayrı) görüntüleme bölgeleri (Şekil 3C,D); bitişik bölgeler için, görüntüleme için genellikle tek bir objektif merceğin çoklu ışınlarını kullanır (Şekil 3E,F). Çok ışınlı tarama tekniği, ışık kaynağı sonrası ayırma yöntemi veya uzay-zaman çoğullama yöntemi ile çözülebilen uyarma ışınları arasındaki karışma sorununa özel dikkat göstermelidir. Post-hoc ışık kaynağı ayırma yöntemi, paraziti ortadan kaldırmak için ışınları ayırmak için algoritmaların kullanılması anlamına gelir; zaman-uzay çoğullama yöntemi, birden fazla uyarma ışınının eşzamanlı kullanımına atıfta bulunur, her bir ışının darbeleri, farklı ışınlar tarafından uyarılan bireysel ışınlar geçici olarak ayrılabilecek şekilde zaman içinde geciktirilir. floresan sinyali. Daha fazla ışın eklenerek daha fazla nöron görüntülenebilir, ancak çoklu ışınlar, sinyal kaynaklarını ayırt etme yeteneğini sınırlayan floresan bozulma süresinin üst üste binmesini artıracaktır; ve çoğullama, elektronik cihazların çalışma hızı üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir. Yüksek gereksinimler; çok sayıda ışın ayrıca tek bir ışının yaklaşık sinyal-gürültü oranını korumak için daha yüksek lazer gücü gerektirir, bu da kolayca doku hasarına yol açabilir.
Geniş Alan Görüntüleme Teknolojisi
Son yıllarda, farklı MPM teknolojilerinin gelişimi, nöral doku görüntülememizin kapsamını genişletti ve beynin derinliklerinde daha fazla nöronu daha hızlı bir şekilde görüntülememizi sağladı; beyin fonksiyonu.
