Konfokal floresan mikroskobu ile ilgili bilgiler
Konfokal floresan mikroskobunun temel prensibi, numuneyi ışınlamak için odak düzleminde iyi tanımlanmış küçük bir nokta oluşturan bir nokta ışık kaynağı kullanmaktır. Işınlamadan sonra noktanın yaydığı floresans, objektif mercek tarafından toplanır ve orijinal ışınlama yolu boyunca çift yönlü renkli aynadan oluşan spektrofotometreye geri gönderilir. Spektrofotometre floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Işık kaynağı ve dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne delikleri ve algılama iğne delikleri adı verilen iki iğne deliği vardır. İkisinin geometrik boyutları tutarlıdır; yaklaşık 100-200nm; Odak düzlemindeki ışık noktasıyla karşılaştırıldığında bu ikisi eşleniktir, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve sonuçta hem aydınlatma iğne deliğine hem de algılama iğne deliğine aynı anda odaklanabilir. Bu şekilde, odak düzleminden gelen ışık, algılama deliğinin menzili içinde birleşebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından saçılan ışık, algılama deliğinin dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Numuneyi bir lazerle noktadan noktaya tarayarak, fotomultiplier tüpü iğne deliğini tespit ettikten sonra aynı zamanda ışık noktasının karşılık gelen eş odaklı görüntüsünü elde eder ve bu görüntü dijital bir sinyale dönüştürülür ve bilgisayara iletilir. Son olarak ekranda tüm odak düzleminin net bir eş odaklı görüntüsü sentezlenir.
Her odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir ve her zaman belirli bir kalınlığa sahiptir, aynı zamanda optik ince kesit olarak da bilinir. Odak noktasındaki ışık yoğunluğunun odak olmayan noktaya göre çok daha büyük olması ve odak dışı düzlemdeki ışığın iğne delikleri tarafından filtrelenmesi nedeniyle, eş odaklı sistemin alan derinliği yaklaşık olarak sıfırdır. Z ekseni yönü boyunca tarama yaparak, gözlemlenen numunenin odak noktasında iki boyutlu bir optik dilim oluşturan optik tomografi elde edilebilir. XY düzlemi (odak düzlemi) taramasını Z ekseni (optik eksen) taramayla birleştirerek, iki boyutlu görüntülerin sürekli katmanlarının biriktirilmesi ve bunların özel bilgisayar yazılımıyla işlenmesiyle numunenin üç boyutlu bir görüntüsü elde edilebilir.
Algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliği her zaman aynı noktaya odaklanır, böylece odaklanma düzleminin dışında uyarılan floresan, algılama iğne deliğine giremez.
Lazer konfokal mikroskopinin çalışma prensibinin basit ifadesi, ışık kaynağı olarak bir lazer kullanması ve geleneksel floresan mikroskopi görüntülemesine dayanarak bir lazer tarama cihazı ve bir konjuge odaklama cihazı eklemesidir. Dijital görüntü elde etmek ve işlemek için bilgisayar tarafından kontrol edilen bir sistemdir.
