Floresan mikroskobunun geleneksel mikroskopiden farkı nedir?
Yakın zamanda farelerden bazı donmuş kesitler almayı denedim ve şimdi enjekte ettiğim virüsün istenen beyin bölgesinde olup olmadığını görmek için bir floresans mikroskobu kullanmam gerekiyor. Floresan mikroskobunun bazı temel prensiplerinin kısaca incelenmesi gerekiyor, onları da burada paylaşacağım.
Floresan mikroskobu, test edilen nesneyi aydınlatmak için bir ışık kaynağı olarak ultraviyole ışık kullanır, nesnenin bir ışık kaynağı yaymasına neden olur ve ardından nesneyi mikroskop altında gözlemler. Esas olarak immünofloresan hücreler için kullanılan bu sistem, bir ışık kaynağı, filtre plakası sistemi ve göz merceğinin ve objektif merceğin büyütülmesi yoluyla numunenin floresans görüntüsünü gözlemlemek için optik sistemden oluşur. Bu floresan mikroskobu ile sıradan bir optik mikroskop arasındaki farka bir göz atalım.
1. Aydınlatma yöntemleri açısından
Floresan mikroskobunun aydınlatma yöntemi genellikle düşen ışın yöntemini kullanır; bu, ışık kaynağının objektif mercek aracılığıyla test numunesi üzerine yansıtıldığı anlamına gelir.
2. Çözüm açısından
Floresan mikroskobu, ışık kaynağı olarak nispeten kısa dalga boyuna sahip ancak sıradan optik mikroskoplardan daha yüksek çözünürlüğe sahip ultraviyole ışık kullanır.
3. Filtredeki farklılıklar
Bir floresan mikroskobu, biri görünür ışığı filtrelemek için ışık kaynağının önünde, diğeri ise gözleri koruyabilen ultraviyole ışığı filtrelemek için objektif ile mercek arasında olmak üzere iki özel filtre kullanır.
Floresan mikroskobu aynı zamanda bir tür optik mikroskoptur, çünkü floresan mikroskobu tarafından uyarılan dalga boyu kısadır, bu da floresan mikroskobu ile sıradan mikroskopinin yapısında ve kullanımında farklılıklara yol açar. Çoğu floresan mikroskobu zayıf ışığı yakalama konusunda iyi bir işleve sahiptir, bu nedenle görüntüleme yetenekleri son derece zayıf floresans altında da iyidir. Ayrıca son yıllarda floresan mikroskobunun sürekli gelişmesiyle gürültü de önemli ölçüde azaldı. Bu nedenle giderek daha fazla floresans mikroskopları kullanılıyor.
İki fotonlu floresans mikroskobu ile ilgili bilgiler
İki fotonlu uyarımın temel prensibi, yüksek foton yoğunluğunda, floresan moleküllerin aynı anda iki uzun dalga boylu fotonu emebilmesi ve uyarılmış durum ömrü olarak adlandırılan kısa bir sürenin ardından daha kısa dalga boylu bir foton yaymasıdır; Etkisi, floresan molekülleri uyarmak için uzun dalga boyunun yarısı kadar dalga boyuna sahip bir fotonun kullanılmasıyla aynıdır. İki foton uyarımı, yüksek bir foton yoğunluğu gerektirir ve hücrelere zarar vermekten kaçınmak için, iki fotonlu bir mikroskopta yüksek enerjili mod kilitli bir darbe lazeri kullanılır. Bu tür lazer tarafından yayılan lazer, yalnızca 100 femtosaniyelik bir darbe genişliği ve 80 ila 100 megahertz'e kadar bir frekansla yüksek tepe enerjisine ve düşük ortalama enerjiye sahiptir. Darbeli bir lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal açıklıklı bir objektif kullanıldığında, objektifin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki fotonlu uyarım yalnızca objektifin odak noktasında meydana gelir. Bu nedenle, iki fotonlu bir mikroskop, eş odaklı iğne delikleri gerektirmez, bu da floresans tespitinin verimliliğini artırır.
Genel floresans olgusunda, uyarılmanın düşük foton yoğunluğu nedeniyle, bir floresan molekülü aynı anda yalnızca bir fotonu soğurabilir ve daha sonra tek fotonlu floresans adı verilen radyasyon geçişi yoluyla bir floresan foton yayabilir. Işık kaynağı olarak lazerin kullanıldığı floresans uyarma işlemi için, iki fotonlu veya hatta çok fotonlu floresans olgusu meydana gelebilir. Şu anda, kullanılan uyarma ışık kaynağı yüksek yoğunluktadır ve foton yoğunluğu, floresan moleküllerin aynı anda iki fotonu absorbe etme gereksinimini karşılar. Uyarma ışık kaynağı olarak tipik bir lazerin kullanılması sürecinde, foton yoğunluğu hala iki fotonlu soğurma olgusunu oluşturmak için yeterli değildir. Tipik olarak femtosaniye darbe lazerleri kullanılır ve anlık güçleri megawatt seviyesine ulaşabilir. Bu nedenle, iki fotonlu floresansın dalga boyu, yarım uyarılma dalga boyu uyarılmasının ürettiği etkiye eşdeğer olan uyarılma dalga boyundan daha kısadır.
