Floresan mikroskobu geleneksel mikroskopiden farklıdır
Floresan mikroskoplar, incelenecek nesneyi ışınlamak için bir ışık kaynağı olarak ultraviyole ışık kullanır, böylece nesne ışık yayar ve ardından nesneyi mikroskop altında gözlemler. Esas olarak immünofloresan hücreler için kullanılır. Esas olarak bir ışık kaynağı, bir filtre plakası sistemi ve numunenin floresan görüntüsünü mercek ve objektif merceğin büyütülmesi yoluyla gözlemlemek için bir optik sistemden oluşur. Bu floresan mikroskobu ile sıradan bir optik mikroskop arasındaki farka bir göz atalım.
1. Aydınlatma yöntemine bakın
Floresan mikroskobunun aydınlatma yöntemi genellikle episkopiktir, yani ışık kaynağı objektif mercek aracılığıyla test numunesi üzerine yansıtılır.
2. Çözünürlüğe bakın
Floresan mikroskoplar, ışık kaynağı olarak ultraviyole ışık kullanır ve dalga boyu nispeten kısadır, ancak çözünürlük, sıradan optik mikroskoplardan daha yüksektir.
3. Filtredeki fark
Floresan mikroskoplar, görünür ışığı filtrelemek için ışık kaynağının önünde kullanılan ve insan gözünü koruyabilen ultraviyole ışınları filtrelemek için objektif mercek ile göz merceği arasında kullanılan iki özel filtre kullanır.
Floresan mikroskobu aynı zamanda bir tür optik mikroskoptur, çünkü floresan mikroskobu tarafından uyarılan dalga boyu kısadır, bu nedenle floresan mikroskobu ile sıradan mikroskop arasındaki yapı ve kullanım farklılığına yol açar. Floresan mikroskopların çoğu, zayıf ışığı yakalama konusunda iyi bir işleve sahiptir, bu nedenle son derece zayıf floresans altında görüntüleme yeteneği de iyidir. Son yıllarda floresans mikroskoplarının sürekli gelişmesiyle birlikte gürültü de büyük ölçüde azaldı. Bu nedenle giderek daha fazla floresans mikroskopları kullanılmaktadır.
çift
Foton Floresan Mikroskobu Hakkında Bilgi
İki fotonlu uyarımın temel prensibi şudur: yüksek foton yoğunluğu durumunda, floresan moleküller aynı anda iki uzun dalga boylu fotonu soğurabilir ve kısa bir sözde uyarılmış durum ömründen sonra daha kısa dalga boylu bir foton yayabilir; etki, floresan molekülleri uyarmak için uzun dalga boyunun yarısı kadar dalga boyuna sahip bir fotonun kullanılmasıyla aynıdır. İki fotonlu uyarım, yüksek foton yoğunluğunu gerektirir. Hücrelere zarar vermemek için iki fotonlu mikroskopi, yüksek enerjili mod kilitli darbeli lazerler kullanır. Bu lazerin yaydığı lazer yüksek tepe enerjisine ve düşük ortalama enerjiye sahiptir, darbe genişliği yalnızca 100 femtosaniyedir ve frekansı 80 ila 100 megahertz'e ulaşabilir. Darbeli lazerin fotonlarını odaklamak için yüksek sayısal açıklıklı bir objektif lens kullanıldığında, objektif merceğin odak noktasındaki foton yoğunluğu en yüksektir ve iki fotonlu uyarım yalnızca objektif merceğin odak noktasında meydana gelir, dolayısıyla iki fotonlu mikroskop, eş odaklı bir iğne deliği gerektirmez, bu da floresans algılama verimliliğini artırır.
Genel floresans olgusunda, uyarım ışığının düşük foton yoğunluğu nedeniyle, bir floresan molekülü aynı anda yalnızca bir fotonu soğurabilir ve daha sonra tek fotonlu floresans olan ışınımsal bir geçiş yoluyla bir floresan foton yayabilir. Işık kaynağı olarak lazerin kullanıldığı floresans uyarma işlemi için, iki fotonlu veya hatta çoklu fotonlu floresans meydana gelebilir. Şu anda, kullanılan uyarma ışık kaynağının yoğunluğu yüksektir ve foton yoğunluğu, aynı anda iki fotonu emen floresan moleküllerin gereksinimlerini karşılar. Uyarma ışık kaynağı olarak genel bir lazerin kullanılması sürecinde, foton yoğunluğu hala iki foton soğurma olayını üretmek için yeterli değildir. Genellikle femtosaniye darbeli lazer kullanılır ve anlık gücü megawatt mertebesine ulaşabilir. Bu nedenle, iki fotonlu floresansın dalga boyu, uyarım ışığının dalga boyundan daha kısadır; bu, uyarım dalga boyunun yarısında uyarımın ürettiği etkiye eşdeğerdir.
İki fotonlu floresans mikroskobunun birçok avantajı vardır:
1) Uzun dalga boylu ışık, kısa dalga boylu ışıktan daha az saçılmadan etkilenir ve numuneye kolayca nüfuz eder;
2) Odak düzleminin dışındaki floresan moleküller uyarılmaz, böylece daha fazla uyarılma ışığı odak düzlemine ulaşabilir, böylece uyarma ışığı daha derin numunelere nüfuz edebilir;
3) Uzun dalga boylu yakın kızılötesi ışık, hücreler için kısa dalga boylu ışığa göre daha az toksiktir;
4) Numuneleri gözlemlemek için iki fotonlu bir mikroskop kullanıldığında, ışıkla ağartma ve fototoksisite yalnızca odak düzleminde meydana gelir. Bu nedenle, iki fotonlu mikroskopi, kalın örneklerin gözlemlenmesi, canlı hücrelerin gözlemlenmesi veya spot ışıkla ağartma deneyleri için tek fotonlu mikroskopiden daha uygundur.
Konfokal floresan mikroskobu hakkında bilgi
Konfokal floresan mikroskobunun temel prensibi: numune bir nokta ışık kaynağı tarafından ışınlanır ve odak düzleminde küçük, iyi tanımlanmış bir ışık noktası oluşturulur. Nokta ışınlandıktan sonra yayılan floresans, objektif lens tarafından toplanır ve orijinal aydınlatma yolu boyunca dikroik bir aynadan oluşan ışın ayırıcıya geri gönderilir. Işın ayırıcı floresanı doğrudan dedektöre gönderir. Işık kaynağının ve dedektörün önünde sırasıyla aydınlatma iğne deliği ve algılama iğne deliği adı verilen bir iğne deliği vardır. İkisinin geometrik boyutu aynıdır, yaklaşık 100-200nm; Odak düzlemindeki ışık noktasına göre, ikisi eşleniktir, yani ışık noktası bir dizi mercekten geçer ve son olarak aynı anda aydınlatma iğne deliğine ve algılama iğne deliğine odaklanabilir. Bu sayede odak düzleminden gelen ışık, algılama deliği kapsamı içinde birleştirilebilirken, odak düzleminin üstünden veya altından saçılan ışık, algılama deliğinin dışında bloke edilir ve görüntülenemez. Lazer numuneyi noktadan noktaya tarar ve iğne deliğini tespit ettikten sonra fotoçoğaltıcı tüp aynı zamanda karşılık gelen ışık noktasının eş odaklı görüntüsünü elde eder, bu da dijital bir sinyale dönüştürülür ve bilgisayara iletilir ve son olarak net bir şekilde toplanır. Ekrandaki tüm odak düzleminin eş odaklı görüntüsü.
Her odak düzlemi görüntüsü aslında numunenin optik bir kesitidir ve bu optik kesit her zaman optik ince kesit olarak da bilinen belirli bir kalınlığa sahiptir. Odak noktasındaki ışık yoğunluğu, odak dışı noktaya göre çok daha büyük olduğundan ve odak dışı düzlem ışığı iğne deliği tarafından filtrelendiğinden, eş odaklı sistemin alan derinliği yaklaşık olarak sıfırdır ve odak noktası boyunca tarama yapılır. Z ekseni, gözlemlenecek numunenin odaklandığı noktada iki boyutlu bir optik dilim oluşturarak optik tomografiyi gerçekleştirebilir. XY düzlemi (odak düzlemi) taramasını Z ekseni (optik eksen) taramayla birleştirerek, sürekli katmanların iki boyutlu görüntülerinin biriktirilmesi ve özel bilgisayar yazılımı ile işlenmesiyle numunenin üç boyutlu görüntüsü elde edilebilmektedir.
Yani, algılama iğne deliği ve ışık kaynağı iğne deliği her zaman aynı noktaya odaklanır, böylece odak düzleminin dışında uyarılan floresans algılama iğne deliğine giremez.
Lazer konfokalin çalışma prensibinin basit ifadesi, ışık kaynağı olarak lazer ışığını kullanmasıdır. Geleneksel floresans mikroskobu görüntülemesine dayanarak, bir lazer tarama cihazı ve bir konjuge odaklama cihazı ekler ve bilgisayar kontrolü yoluyla dijital görüntü elde etme ve işlemeye yönelik bir sistemdir.
