Konfokal Lazer Mikroskopinin Özellikleri ve Uygulamaları
Lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM), eşlenik odak teknolojisine dayalı olarak tasarlanmış, yani lazer ışık kaynağı, test edilen numune ve detektörü birbirinin eşlenik konumunda yapmak için tasarlanmış bir mikroskop türüdür.
Esas
Genel mikroskoplarda, objektif merceğin odak düzlemi dedektörle çakışır, böylece gözlenen görüntü düzlemi bitişik eksenel düzlemden izole edilirken, konfokal mikroskoplarda numune kırınımla sınırlı bir ışık spotu kullanılarak aydınlatılır ve Bu izolasyon etkisi, çözünürlüğü iyileştirmek için kaçak ışığı filtrelemek için spot konjugatının odak noktasında toplama ışık yolunda bir iğne deliği kullanılarak elde edilir.
Görüntüleme Özellikleri
Toplama ışık yolundaki küçük delikten yalnızca eşlenik numune katmanından geri yansıyan ışık geçebilir ve geri kalan ilgisiz numune katmanı yansımaları küçük delik tarafından bloke edilir. Bu, çözünürlükte önemli bir artışa neden olabilir. Aşağıda gösterilen, aynı kalın numunenin çok boyutlu floresan mikroskopisi ve konfokal mikroskopisinin yan yana karşılaştırmasıdır. Farklı odak düzlemlerinde bir dizi görüntü alındığında, genellikle "z yığını" olarak adlandırılan şey oluşturulabilir ve bu görüntü, konfokal mikroskopinin sunduğu çözünürlük ve kontrast kazanımlarını ve bu kazanımların altında yatan nedenleri gösterir. Yığının tepesindeki görüntü, görüntüleme düzlemi dokunun üzerinde olacak şekilde incelendiğinde, floresan görüntüde çok fazla dağınık ışık ortaya çıkarken, konfokal görüntü siyah görünüyor. Eksenel yönde PSF'deki bu azalma, z yığınının ortasındaki optik arabirimde gözlenen çözünürlük farkından doğrudan sorumludur.
Lazer taramalı konfokal mikroskopinin bir diğer özelliği de taramalı görüntüleme teknolojisi olmasıdır. Geleneksel geniş alan aydınlatma teknolojisi tüm numuneyi aydınlatır, böylece görüntü doğrudan çıplak gözle veya bir detektör tarafından yakalanabilir, ancak LSCM tarama ve görüntüleme için numuneden bir ışın veya Çoklu odaklanmış ışınlar kullanır ve ortaya çıkan görüntü optik bölüm denir. Aşağıda, geleneksel geniş alan aydınlatma yöntemi ile lazer taramalı konfokal aydınlatma yöntemi arasındaki fark gösterilmektedir.
Bu nedenle, modern bir eş odaklı mikroskobun pratik bir çalışma yöntemi aşağıdaki şekilde gösterilmektedir. Lazerin yaydığı uyarım ışığı dikroik bir aynadan geçer ve bir çift titreşimli ayna aracılığıyla numunenin x ve y yönlerinde tarar. Numunenin uyarılması (veya yansıması) Işık PMT detektörüne iğne deliğinden girer ve kaydedilir ve kaydedilen tarama görüntüsü, gerçek numune görüntüsünü elde etmek için bilgisayar tarafından yeniden oluşturulur.
