Floresan mikroskobu ile sıradan optik mikroskop arasındaki farklar ve özellikler
Floresan mikroskobu sıradan optik mikroskoptan farklıdır. Numuneyi sıradan bir ışık kaynağının aydınlatmasıyla gözlemlemez. Bunun yerine, mikroskop altında numunedeki floresan malzemeyi uyarmak ve floresans yaymasına neden olmak için belirli bir dalga boyundaki ışığı (genellikle ultraviyole ışık, mavi-mor ışık) kullanır. Bu nedenle, floresan mikroskobunun ışık kaynağı doğrudan aydınlatma görevi görmez, numunenin dahili floresan malzemesini harekete geçiren bir enerji kaynağı olarak hizmet eder. Numuneyi gözlemleyebilmemizin nedeni, ışık kaynağının aydınlanmasından değil, numunedeki flüoresan malzemenin uyarılmış ışık enerjisini absorbe etmesinden kaynaklanan flüoresans olgusundan kaynaklanmaktadır. Bir floresans mikroskobunun ana özelliğinin, ışık kaynağının belirli bir dalga boyu aralığında büyük miktarda uyarım ışığı sağlayabilmesi, böylece incelenen numunedeki floresan maddelerin gerekli uyarım ışığı yoğunluğunu elde edebilmesi olduğu görülebilir. Aynı zamanda floresans mikroskoplarının uygun filtre sistemlerine sahip olması gerekir. Floresan mikroskobu, ileri floresans histokimyası için önemli bir araçtır. Ultra yüksek basınçlı ışık kaynağı, filtre sistemi (uyarma ve bastırma filtre plakaları dahil), optik sistem ve fotoğraf sisteminden oluşur. Numuneyi floresans yaymaya teşvik etmek için belirli bir dalga boyundaki ışığı kullanır.
1. Floresansı uyarmanın yolları: Işığın dalga boyu aralığına göre iki türe ayrılır: UV uyarma yöntemi (ultraviyole aydınlatma yöntemi kullanılarak) ve BV uyarma yöntemi (mavi-mor ışık kullanılarak). UV uyarma yöntemi, uyarma için 400 nm'den kısa ultraviyole yakın ışık kullanır. Bu yöntemde görünür bir uyarma ışığı yoktur, bu nedenle gözlemlenen floresans, boyanın doğal floresansını gösterir ve numune üzerindeki spesifik floresansın arka plan dokusunun otofloresansından ayırt edilmesini kolaylaştırır.
2. BV uyarma yöntemi: ultraviyoleden 404 nm ve 434 nm'de merkezlenen mavi ışığa uyarma. Bu yöntem, numuneyi aydınlatmak için mavi ışık kullanır, bu nedenle floresans gözlem sisteminin kesme filtresinin, mavi ışığı tamamen engelleyebilen ve gerekli yeşil ve sarı floresanı tamamen geçirebilen bir filtre kullanması gerekir. Floresan antikor yöntemlerinde kullanılan floresan boyalar. Uyarma ışığının maksimum absorpsiyon dalga boyu ve floresansın maksimum emisyon dalga boyu nispeten yakındır, bu nedenle BV uyarma yönteminde kullanılan filtrenin keskin bir kesme filtresi kullanması gerekir. Bu yöntem, uyarma ışığı olarak mavi ışığı kullanabilir, böylece floresan pigmentlerin emme verimliliği daha yüksek olur ve daha parlak görüntüler elde edilebilir. Dezavantajı ise 500 nm'nin altındaki floresansın görülememesi, 500 nm'nin üzerindeki floresansın ise tüm görüntünün sarı görünmesine neden olmasıdır. Floresan antikor yönteminde, floresan boyanın özgüllüğü çoğunlukla benzersiz rengine göre değerlendirilir. Bu nedenle, incelikli özgüllüğü tartışırken, BV uyarma yönteminin yukarıda belirtilen eksikliklerinin çoğu zaman büyük bir etkisi vardır.
