Konfokal mikroskop ile sıradan optik mikroskop arasındaki karşılaştırma
Genel optik mikroskop
Genel biyolojik mikroskop üç bölümden oluşur: ① ışık kaynağı ve yoğunlaştırıcı dahil aydınlatma sistemi; ② Objektif lens ve mercekten oluşan optik amplifikasyon sistemi mikroskobun ana gövdesidir. Küresel sapmayı ve renk sapmasını ortadan kaldırmak için hem göz merceği hem de objektif merceği karmaşık mercek gruplarından oluşur; (3) malzemeleri sabitlemek ve uygun gözlem için kullanılan mekanik cihaz.
Mikroskop görüntüsünün net olup olmaması sadece büyütmeye değil aynı zamanda mikroskobun çözünürlüğüne de bağlıdır. Çözünürlük, mikroskobun (veya insan gözünün hedeften 25 cm uzakta olduğu yerin) nesne zui'sinin küçük aralığını ayırt etme yeteneğini ifade eder. Çözünürlük, aşağıdaki formülle ifade edilen, ışığın dalga boyuna, açıklık oranına ve ortamın kırılma indisine bağlıdır:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Burada: n= ortamın kırılma indisi;=ayna açısı (numunenin mercek açıklığına açılma açısı) ve NA= sayısal açıklık. Ayna açısı her zaman 180'den az mı? Bu nedenle sina/2'nin zui değerinin 1'den küçük olması gerekir.
Optik lens yapımında kullanılan camın kırılma indisi 1,65~1,78'dir ve kullanılan ortamın kırılma indisi camın kırılma indisine ne kadar yakınsa o kadar iyidir. Kuru objektif lens için ortam havadır ve açıklık oranı genellikle 0.05 ~ 0,95'tir; Yağ merceği ortam olarak kokulu asfalt kullanır ve mercek açılma oranı 1,5'e yakın olabilir.
Sıradan ışığın dalga boyu 400~700nm'dir, dolayısıyla mikroskobun çözünürlüğü 0,2μm'den az değildir ve insan gözünün çözünürlüğü 0,2 mm'dir, dolayısıyla zui'nin büyük büyütmesi tarafından tasarlanmıştır. genel mikroskop genellikle 1000X x'tir.
Neden eş odaklı bir mikroskoba ihtiyacınız var?
1. Optik mikroskop, büyük öncüllerimizin çabaları ve iyileştirmeleri sayesinde mükemmelleştirilmiştir. Aslında sıradan mikroskoplar bize basit ve hızlı bir şekilde güzel mikroskobik görüntüler sağlayabilir. Ancak bu neredeyse mükemmel mikroskop dünyasına devrim niteliğinde bir yenilik getiren bir olay yaşandı: "Lazer taramalı eş odaklı mikroskobun" icadı. Bu yeni mikroskop, yalnızca odağın yoğunlaştığı düzlemdeki görüntü bilgisini çıkaran ve odağı değiştirirken elde edilen bilgiyi görüntü belleğine geri yükleyen bir optik sistemin benimsenmesiyle karakterize edilir, böylece tam üç boyutlu bilgi içeren canlı bir görüntü elde edilir. elde edilebilir. Bu yöntemle yüzey şekli hakkında sıradan mikroskoplarla doğrulanamayan bilgiler kolaylıkla elde edilebiliyor. Ayrıca sıradan optik mikroskoplar için "çözünürlüğün iyileştirilmesi" ve "odak derinliğinin derinleştirilmesi" özellikle yüksek büyütmede çelişkili koşullardır, ancak konfokal mikroskoplar için bu sorun çözülmüştür.
2. Eş odaklı optik sistemin avantajları
Konfokal optik sistem örnek noktayı aydınlatır ve yansıyan ışık da nokta reseptörleri tarafından alınır. Numune odak konumuna yerleştirildiğinde yansıyan ışığın neredeyse tamamı fotoreseptöre ulaşabilir, ancak numune odak noktasından saptığında yansıyan ışık fotoreseptöre ulaşamaz. Yani konfokal optik sistemde sadece odağa denk gelen görüntü çıkacak, facula ve gereksiz dağınık ışık perdelenecektir.
3. Neden lazer kullanmalısınız?
Konfokal optik sistemde numune aydınlatılır ve yansıyan ışık da bir nokta fotoreseptör tarafından alınır. Bu nedenle noktasal ışık kaynağına ihtiyaç duyulmaktadır. Lazer çok noktasal bir ışık kaynağına aittir. Çoğu durumda, konfokal mikroskobun ışık kaynağı lazer ışık kaynağını kullanır. Ayrıca lazerin tek renklilik, yönlülük ve mükemmel ışın şekli gibi özellikleri de yaygın kullanımının önemli nedenleridir.
4. Yüksek hızlı taramaya dayalı gerçek zamanlı gözlem mümkün hale gelir.
Lazer taramada yatay yönde Akustik Optik Deflektör (AO prime element), dikey yönde ise Servo Galvano-ayna kullanılmaktadır. Akustik optik saptırma ünitesinde mekanik titreşim parçası bulunmadığından yüksek hızda tarama yapabilir ve izleme ekranında gerçek zamanlı olarak gözlem yapmak mümkündür. Bu kameranın yüksek hızı, odaklanma ve konum alma hızını doğrudan etkileyen çok önemli bir projedir.
5. Odak konumu ile parlaklık arasındaki ilişki
Konfokal optik sistemde, numune odak konumuna doğru yerleştirildiğinde parlaklık büyüktür ve ondan önce ve sonra parlaklığı keskin bir şekilde düşecektir (Şekil 4'teki düz çizgi). Odak düzleminin bu hassas seçiciliği aynı zamanda konfokal mikroskobun yükseklik yönünün ölçülmesi ve odak derinliğinin genişletilmesi ilkesidir. Bunun tersine, sıradan optik mikroskopta odaklama konumundan önce ve sonra belirgin bir parlaklık değişimi görülmez (Şekil 4'teki noktalı çizgi).
6. Yüksek kontrast ve yüksek çözünürlük
Genel olarak optik mikroskopta, odak noktasından sapan yansıyan ışık girişime neden olacak ve odak görüntüleme kısmı ile örtüşerek görüntü kontrastını azaltacaktır. Bunun aksine, konfokal optik sistemde, odak dışındaki saçılan ışık ve objektif merceği içindeki saçılan ışık neredeyse tamamen ortadan kaldırılır, böylece çok yüksek kontrastlı bir görüntü elde edilebilir. Ayrıca ışık objektif merceğinden iki kez geçtiği için öncelikle nokta görüntüsü keskinleştirilir ve mikroskobun çözünürlüğü de iyileştirilir.
7. Optik yerelleştirme işlevi
Konfokal optik sistemde odak noktası dışındaki parçanın yansıyan ışığı mikro gözenekler tarafından perdelenir. Dolayısıyla üç boyutlu bir numune incelenirken numunenin odakla dilimlenmesiyle oluşan görüntüye benzer bir görüntü oluşur (Şekil 5). Bu etkiye, konfokal optik sistemin özelliklerinden birine ait olan optik lokalizasyon adı verilmektedir.
8. Hareketli hafıza fonksiyonuna odaklanın
Odak noktasının dışındaki yansıyan ışık, mikro gözenekler tarafından korunur. Öte yandan eş odaklı optik sistemin oluşturduğu görüntü üzerindeki tüm noktaların odakla çakıştığı düşünülebilir. Bu nedenle, üç boyutlu örnek Z ekseni (optik eksen) yönünde hareket ettirilirse görüntü biriktirilecek ve hafızada saklanacak ve zui sonunda tüm örnek ile odağın çakışmasıyla oluşan görüntüyü elde edecektir. . Bu şekilde sonsuz odak derinliği fonksiyonuna mobil hafıza fonksiyonu adı verilmektedir.
9. Yüzey şekli ölçüm fonksiyonu
Odak hareket ettirme fonksiyonunda, numunenin yüzey şekli, bir yükseklik kayıt döngüsü eklenerek temassız bir şekilde ölçülebilir. Bu fonksiyona dayanarak, her pikseldeki zui'nin büyük parlaklık değerinin oluşturduğu Z ekseni koordinatlarının kaydedilmesi mümkün olmakta ve bu bilgiye dayanarak numunenin yüzey şekline ilişkin bilgiler elde edilebilmektedir.
10. Yüksek hassasiyetli mikro boyutlu ölçüm fonksiyonu
Işık alma ünitesi tek boyutlu bir CCD görüntüleme sensörünü benimser, böylece tarama cihazının tarama eğiminden etkilenmez, böylece yüksek hassasiyetli ölçüm tamamlanabilir. Ayrıca, ayarlanabilir odak derinliğine sahip odak hareketli hafıza fonksiyonu aynı anda benimsendiği için odak ofsetinden kaynaklanan ölçüm hatası da ortadan kaldırılabiliyor.
11. Üç boyutlu görüntü analizi
Yüzey şekli ölçüm fonksiyonu kullanılarak numune yüzeyinin üç boyutlu görüntüsü kolaylıkla oluşturulabilir. Sadece bu değil, aynı zamanda yüzey pürüzlülüğü ölçümü, alan, hacim, yüzey alanı, dairesellik, yarıçap, zui uzunluğu, çevre, ağırlık merkezi, tomografik görüntü, FFT dönüşümü, çizgi gibi birçok analiz türü de gerçekleştirilebilir. genişlik ölçümü vb.
Lazer eş odaklı tarama mikroskobu yalnızca hücre morfolojisini gözlemlemek için değil, aynı zamanda hücrelerdeki biyokimyasal bileşenlerin kantitatif analizi, optik yoğunluk istatistikleri ve hücre morfolojisi ölçümü için de kullanılabilir.
